微生物的生长 及其控制

第一节 微生物纯培养的获得 平板划线分离法 稀释倒平板法 单孢子或单细胞分离法 利用选择性培养基分离法

1.平板划线分离法 用接种环沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

2.稀释倒平板法

3.单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个孢子进行培养以获得纯培养。 在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。

4.选择性培养基分离法 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。

微生物纯培养分离方法的比较 分离方法 应用范围 平皿划线法 方法简便，多用于分离细菌 稀释倒平皿法 可定性、定量，用途广泛 单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究 利用选择培养基法 分离生理类型较特殊的微生物

第二节 微生物生长繁殖测定方法 生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加,即原生质的总量的增加 生长 繁殖 第二节 微生物生长繁殖测定方法 生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加,即原生质的总量的增加 生长 繁殖 指微生物个体数目的增加 在单细胞微生物中，生长繁殖速度很快，且两者交替进行，个体生长与繁殖界限难以划清，因此实际上常用群体生长作为衡量微生物生长的指标。 群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程 群体生长：个体生长＋个体繁殖

评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响 微生物生长繁殖 评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果 客观地反映微生物生长的规律

微生物生长量测量方法 刻度试管法 干重法 比浊法 生理指标法

刻度试管法:通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。 取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间和转速，离心后倒出上清夜，测上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。 菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

HCDC174 g/L 重量法 原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。 重量法 原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。 每个E.coli细胞干重为2.8×10-13 g，细胞浓 度通常为2.0×109个/ml，每升培养物的细 胞干重为多少？ HCDC174 g/L

比浊法：分光光度计测定 原位测定 蛋白质总量＝含氮量×6.25 生理指标法：含N量、含C量、P、DNA、RNA、 耗氧、粘度、热等 蛋白质总量＝含氮量×6.25

微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、 产气、粘度、生物热等与其群体的规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。 应用于对微生物的快速鉴定与检测方法

在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。

二、计数（适用单细胞） a.直接法 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 缺点：不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 改进：染料染色—可区分死菌与活菌

b活菌计数法：活菌使液体培养基变混或在固体培养基上形成菌落

一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 采用培养平板计数法要求操作熟练 准确，否则难以得到正确的结果： 样品充分混匀； 每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液； 同一稀释度三个以上重复,取平均值； 每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数； 一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。

计数：早、多

C其它 小型商品化产品：在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基， 加入活性指示剂TTC，待蘸取测试菌液后置密封包装袋 培养。培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落 与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。 菌数快速检测系统:原理是利用电阻抗法将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化。

第三节 微生物的生长规律 一、细菌的生长 分裂为二等分裂。大肠杆菌在培养过程中，细胞延长至大约为细胞最小长度的 2 倍时，处于细胞中间部位的细胞膜和细胞壁从两个相反的方向向内延伸，逐渐形成一个隔膜，直至 2 个子细胞被分割开，最终分裂形成 2 个子细胞。在适宜的条件下，大肠杆菌完成一个周期仅需大约 20 分钟。

二、细菌群体生长规律 生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线 细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，生长曲线以培养时间为横坐标、以细胞数目的对数值为纵坐标，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 生长速率常数：即每小时分裂次数（R）,根据生长速率常数，可把典型生长曲线（细菌及酵母菌）分为延滞期、指数期、稳定期、衰亡期这四个时期。

细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图

典型生长曲线可分： 延滞期 指数期 稳定期 衰亡期

1.延滞期(lag phase) 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期、停滞期、调整期。 延滞期的特点：生长速率常数为0；细胞变大或增长； RNA含量增高，原生质呈嗜碱性； 分裂迟缓、合成代谢活跃； 对外界不良条件敏感 出现原因： 缺乏分解或催化底物的酶或辅酶 缺乏充足的中间代谢物

影响因子： 接种龄—对数期接种则延滞期短 接种量—接种量大则延滞期短 培养基成分—营养丰富的天然培养基、 接种前后培养基成分相差小则延滞期短

2.指数期（对数期, exponential phase） 以最大的速率生长，细胞数量呈几何级数增加 特点：生长速率常数最大；细胞进行平衡生长； 酶系活跃，代谢旺盛 对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的延滞期缩短，提高经济效益

①。

代时影响因子： 菌种:E.coli：12.5-17；结核分枝杆菌：792-932. 营养成分：营养丰富则短。37℃, E.coli在牛奶中代 时为 12.5 min, ，肉汤培养基中为17 min. 营养物浓度：浓度极低—影响生长速率和菌体产量 升高浓度—仅影响菌体产量 升高到一定程度—对生长速率和菌体产量无影响 培养温度的影响：教材155

生长限制因子：在微生物培养中，凡处于较低浓度范围 内可影响生长速率和菌体产量的某营养物 倍增时间：原生质增加一倍所需的时间。 纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次； 九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的 CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌 的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。

3.稳定期 (Stationary phase) 原因： 由于营养物质消耗、比例失调、代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率常数降低直至零。 特点： ①微生物的生长处于动态平衡，培养物 中的细胞数目达到最高值。 ②开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 ③此时期的微生物开始合成次生代谢产物。对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。

4.衰亡期 现象： 细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊。 特点： 死亡>出生，分解代谢>合成代谢

第四节 微生物培养法 研究进展 固体培养→液体培养→液体搅拌 单批培养→多级连续培养 微生物培养→动物、植物培养 遗传菌株培养 高密度培养 自动化培养

一、固体培养 好氧菌：试管斜面 培养皿琼脂平板 厌氧菌：培养基中需加入还原剂 高层琼脂柱 厌氧罐 厌氧手套箱

厌氧罐：抽气换气法或内源性产气袋排 空气；钯催化剂催化氢气反应除残氧； 美蓝指示剂显示无色 厌氧手套箱：箱内充混合气； 钯催化剂催化氢气反应除残氧； 有抽气换气室

二、同步培养 1.概念 同步培养(synchronous culture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。 同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。

离心方法 机械方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法 同步培养方法 氯霉素抑制蛋白 芽孢诱导发芽 环境条件控制技术 温度 光照和黑暗交替培养

硝酸纤维素滤膜法 离心法

三、连续培养 将微生物置于一定容积的培养基中，经过 培养生长，最后一次收获。 分批培养（batch culture）or 封闭培养（closed culture） 培养基一次加入，不予补充，不再更换。

连续培养的基本原则：生长曲线为基础，培养中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物——加入培养基、空气，搅拌，流出培养物 连续培养(continous culture 是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 连续培养的基本原则：生长曲线为基础，培养中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物——加入培养基、空气，搅拌，流出培养物 恒浊连续培养 连续培养类型 恒化连续培养

(一)恒化连续培养 在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的生长速率恒定（低于最高生长速率），使生长“不断”进行。 生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质 恒化连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。

(二)恒浊连续培养 通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。 用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产

分别列出两种实验室、生产常用的C源、N源。 从能源、氢供体、碳源方面综合考虑，微生物主要可分为哪几种营养类型？列表说明其各自特点，分别说明各类型能源、氢供体、基本碳源情况，并每个举一个例子。说明你对其中哪几个方面不理解或理解的较差？

数量过少时如何计数？