乳酸杆菌对仔猪肠道非益生菌群粘附细胞的抑制作用的研究 石河子大学“国家大学生创新创业训练计划”项目中期检查报告

指导老师：蒋 建 军 小组成员：凌 晨 宋 康 钱 莹 马 燕 蒋 光 临

汇报提纲 一、选题来源 二、项目目的、意义 三、项目背景 四、项目内容 五、项目目标 六、项目进度安排 七、预测目标 八、项目进展 九、待解决问题 十、实验体会

选题来源 山东农业大学的一篇博士学位论文《鸡消化道乳酸杆菌的粘附研究》中宿主特异性高粘附性乳酸杆菌菌株筛选的研究和乳酸杆菌粘附肠道上皮细胞粘附因子性质的研究。 在蒋老师的指导下，确定在仔猪肠道上皮细胞研究乳酸杆菌菌株的筛选和乳酸杆菌的表面蛋白的粘附机制。

项目目的、意义 通过建立乳酸杆菌抑制肠道腹泻和病原菌的模型，采用是益生菌群与非益生菌群达到平衡，观察乳酸杆菌对肠道粘附以及对非益生菌的抑制的作用，从而探讨乳酸杆菌对仔猪肠道的保护以及对仔猪生长发育的影响，为制定仔猪肠道保护措施和预防肠道传染病的发生提供实验与理论依据。

项目目的、意义 同时我们小组成员通过此项目训练，不仅可以锻炼我们的独立思考的能力和实践操作能力 ，还可以加强我们对自己所学专业的进一步了解和认识！与此同时，也让我们接触到不少了老师以及老师的科研思想，利于我们以后在自己的事业和认知上有进一步的提拔！

项目背景 仔猪在胚胎时期由于有母体免疫系统的保护，在羊水中处于一个稳定的状态，出生后由于仔猪消化道系统等发育不全以及断奶应激等原因，仔猪经常会发生肠道传染病，严重影响了仔猪的生产性能。一直以来，人们都用抗生素来预防和治疗仔猪痢疾，但抗生素在体内有残留，影响猪肉品质，对人们的健康有着极大的威胁，同时长期使用抗生素严重污染环境，抑制肠道内正常菌群作用的发挥，影响仔猪的生长性能，不利于经济生产。

项目背景 乳酸杆菌的抑制肠道腹泻和病原菌的生物屏障作用、抗癌作用、增强机体免疫力、延缓机体衰老等生理功能，都是通过其黏附于肠上皮细胞表面，定植形成稳定的菌群发挥作用。黏附是乳酸杆菌发挥生物屏障功能的基础，乳酸杆菌与宿主细胞的黏附是其发挥生理作用的首要条件，而有关黏附的特点正成为益生菌研究的热点。

项目内容 1仔猪肠道上皮细胞的培养 1.1肠道上皮细胞的获取 1.2细胞悬液培养 1.3细胞学观察：倒置相差显微镜分别于培养后20min，1-4d观察细胞生长情况。 1.4主要观察指标：①培养20min,1-4d细胞的生长情况。②1-6 d细胞的生长曲线。 1.5统计学分析：采用SPSS13.0软件完成统计处理。

项目内容 2用仔猪肠道中存在的非益生菌去侵染上述培养的细胞。 3对侵染细胞和未侵染的细胞计算，计算细胞被侵染率比较三种细胞的侵染率高低。 4加入益生菌乳酸杆菌0.05uL,在恒温箱中37度培养24h。再同步骤1.2对侵染细胞和未侵染的细胞计算，计算细胞被侵染率，观察于未加入乳酸杆菌得被侵染率。 5乳酸杆菌表面蛋白的筛选和提纯。 6乳酸杆菌表面蛋白对非益生菌在肠道上皮细胞感染过程中的抑制试验。

项目目标 通过建立乳酸杆菌抑制肠道腹泻和病原菌的模型，采用是益生菌群与非益生菌群达到平衡，观察乳酸杆菌对肠道粘附以及对非益生菌的抑制的作用，从而探讨乳酸杆菌对仔猪肠道的保护以及对仔猪生长发育的影响，为制定仔猪肠道保护措施和预防肠道传染病的发生提供实验与理论依据。

项目进度安排 2012 年 01 月～ 2012 年 03 月 实验前期准备； 2012 年 04 月～ 2012 年 05 月 大肠杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌对仔猪肠道上皮组织细胞的侵染并记录 数据； 2012 年 06 月～ 2012 年 07月 乳酸杆菌对非益生菌群 的粘附抑制作用侵染 并记录数据； 2012 年 09 月～ 2012 年 10 月 乳酸杆菌表面蛋白的筛选和提纯以及对非益生菌在肠道上皮细胞感染过程中的抑制试验 2012 年 10 月～ 2012 年 11 月 整理、分析数据，撰写试验论文；撰写结题报告

预测目标 1、阐明乳酸杆菌对被非益生菌侵染的细胞的 抗吸附作用和修复功能的机理。 2、发表二篇核心期刊论文。

蒋光临 宋康 凌晨 马燕 钱莹

项目进展（试剂） 培养瓶 6孔板 胎牛血清（进口） 1.5mL EP管 离心管 双抗（青霉素、链霉素） 微孔滤膜（0.22um） 冻存管 胰蛋白酶 DF12粉 胎牛血清（进口） 1.5mL EP管 双抗（青霉素、链霉素） 冻存管 枪头（1mL）

项目进展（仪器） 细胞培养箱 超净工作台 离心机 液氮罐

项目进展（仪器） 电子天平 高压消毒灭菌锅 倒置相差显微镜

项目进展（试剂配方） PBS 1L 500mL 250mL PH=7 NaCl 8g 4g 2g KCl 0.2g 0.1g 0.05g NaHPO4·12H2O 3.58g 1.79g 0.895g KH2PO4·3H2O 0.272g 0.136g 0.068g

项目进展（学习） 在进行枪头消毒为细胞换液做准备 ↓ ↑ 细胞操作前先进行酒精消毒

在倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长状况 项目进展（学习） 在倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长状况 ↓ ↑ 从细胞培养箱种取出细胞

项目进展（学习） 实验员在接超净水用于去离子水 ↓ ↑ 清洗培养瓶、离心管、导管等

蒋老师为我们讲解和指导

倒置相差显微镜以及电脑处理，拍照处理的热酸杆菌和仔猪肠道上皮细胞图

待解决问题 1、实验设计时步骤的不当 2、实验室的设施不完备（仪器的放置不合理等） 3、资源不能为我们充分的利用 4、实验室的仪器太少 5、人员安排的不合理

心得体会 1、对做实验的重新认识 2、对自己专业的认识也改变 3、老师和学生之间的交流 4、小组成员合作的精神 5、自我的认识

望各位老师批评指正