Chromatography
Chromatography The mixture is dissolved in a fluid called the mobile phase, which carries it through a structure holding another material called the stationary phase. The various constituents of the mixture travel at different speeds, causing them to separate.
層析法中的移動相（mobile phase；即流經管柱 的溶劑）通常是液體或氣體。 靜相（stationary phase；固定於管柱內部的物質） 又稱固定相，則是固體或附著於固體或是毛細 管柱內壁的液體。 在氣相層析法（gas chromatography）中，移動 相為氣體，而在液相層析法（liquid chromatography）中，移動相則是液體。 P.434
進入管柱的流體稱為沖提液（eluent）；離開管 柱的流體稱為析出液（eluate）；將液體或氣體 通過層析管柱的過程則稱為沖提（elution）。 P.434
18-2 我們如何描述層析圖 層析圖（chromatogram）所顯示的是在一個層 析實驗中隨著時間進行（或沖提體積），偵測 器的感應訊號大小（圖 18-3）。 滯留時間（retention time；tr）則是指某個溶質 在注射後到達偵測器所需要的時間。 P.436
圖 18-3 圖 18-3 以圖示方式說明層析圖相關參數，包括滯留時間（tr）與半高峰寬（w1/2）。在基線的成分峰寬度（w）是由成分峰所顯示的高斯曲線斜邊延伸與基線相交的點所決定，高斯曲線的標準偏差為 σ。在氣相層析法中，通常注射 0.1 μL 至 0.2 μL 的甲烷所出現的時間可被視為層析中最早出現的時間，也經常被視為移動動相在管柱中所滯留的時間。 P.437
圖 18-4 圖 18-4 兩個相同面積與高度的高斯峰之間的解析度。虛線部分為個別單一的成分峰，實線則是兩個成分峰的面積和。重疊部分則以陰影表示。 P.438
定性與定量分析 在定性分析的應用方面，要確定層析圖中的成 分峰是哪種成分最簡單的方法是比較已確定物 質與待測物質兩者的滯留時間。更可靠的方式 是利用標準添加法（spiking；也稱 co- chromatography）。 在定量分析上，成分峰的面積與分析物的量成 正比例。 比較面積法與內標法兩種定量方式，後者會得 到比較好的分析物濃度結果。 P.438
由溶質與靜相的作用力不同可以將層析法分成: 吸附層析法（adsorption chromatography） 分配層析法（partition chromatography） 離子交換層析法（ion-exchange chromatography） 分子排除層析法（molecular exclusion chromatography） 親和層析法（affinity chromatography） P.435
18-9 離子交換層析法 離子交換層析法（ion-exchange chromatography） 以離子性溶質與靜相中帶電荷位置之間的作用力 為分離的基礎（圖 18-2）。 陰離子交換介質（anion exchanger）在靜相上具有 帶正電荷的官能基，能夠吸引陰離子。 陽離子交換介質（cation exchanger）則含有陰離 子官能基，能夠吸引陽離子。 陽離子交換樹脂是將帶負電荷的磺酸根（－SO3－） 或羧酸根（－CO2－）接到聚苯乙烯苯環上（圖 18- 48）。 P.480
Ion exchange chromatography R+A- + B- R+B- + A-
圖18-33 圖18-48 聚苯乙烯離子交換樹脂的結構，不同的高分子鏈之間以共價鍵方式交聯在一起。 P.480
離子交換選擇 上述反應的平衡常數稱為選擇係數（selectivity coefficient） 離子的水合半徑（hydrated radius） 是指離子本身的有效半徑加上周圍 被離子的正電荷或負電荷（圖 11-3） 所緊緊束縛的水分子。 P.480-481
在圖 18-49 中，利用改變 [H＋] 的梯度沖提將不 同鑭系陽離子（M3+）分離。 以下是某些離子對樹脂的大略趨勢： 在圖 18-49 中，利用改變 [H＋] 的梯度沖提將不 同鑭系陽離子（M3+）分離。 P.482
圖18-34 圖18-49 利用陽離子交換管柱以 H＋ 梯度沖提的方式（25 分鐘內 20-80 mM HNO3）沖提鑭系(III)元素，梯度沖提可以將牢固的滯留於靜相上的陽離子趕出來。 P.482
18-11 分子排除層析法 在分子排除層析法（molecular exclusion chromatography），也稱 為凝膠過濾層析法或凝膠滲透層析法中，分子藉著分子大小不同 而分離。 由於小分子在管柱中的路徑較長，大分子會先被沖提出來（圖 18-54）。 這個技術廣泛的應用在生化與高分子化學領域中，藉著這個技術 可以純化巨分子與測定巨分子的分子量（圖 18-55）。圖 18-56 是一個應用在材料化學的例子。 P.485
Gel filtration chromatography
圖18-39 圖18-56 以分子排除層析純化奈米碳管。 P.486
Gel filtration chromatography V0：void volume Ve：elution volume
分子量測定 滯留體積（retention volume）是指要將某一個特定溶質沖提出來 所需要的移動相體積。 P.486
解 範例 3 以凝膠過濾層析法進行蛋白質層析，記錄不同分 子量標準品與未知物的滯留體積（Vr），請求出待 測物的分子量（MM）。 以凝膠過濾層析法測定分子量 以凝膠過濾層析法進行蛋白質層析，記錄不同分 子量標準品與未知物的滯留體積（Vr），請求出待 測物的分子量（MM）。 解 P.487
圖18-57 分子排除層析法中依照不同分子量與滯留體積 所得到檢量線。 圖18-40 圖18-57 分子排除層析法中依照不同分子量與滯留體積 所得到檢量線。 P.487
18-12 親和層析法 親和層析法（affinity chromatography）可以分離複雜組成樣品中 某一個特定的單一化合物。
fusion protein: 6-histidine tag 24
Antibody-Au nanoparticles 金奈米粒子的應用: 驗孕片之原理 (免疫層析法)
18-6 氣相層析法 在氣相層析法（gas chromatography）中，氣態的移動相負載著氣 態的溶質通過內含有靜相的長且細的管柱。 管柱 開管式管柱（圖 18-19）的靜相可能是液體或固體，塗佈在內側 管壁（圖 18-20）。 表 18-2 的液態靜相涵蓋了很寬的極性範圍。欲將混和物分離，選 擇靜相的基本原則是「相似者互溶」。 P.454-455
圖 18-15(b) 圖18-22 分離 22 種帶有 1，2 或 3 個雙鍵的 18 碳脂肪酸酯甲基酯。圖 4-3 中的脂肪酸標示在成份峰 3，7 與 14。所使用的管柱是 supelco IL100 離子液體管壁塗布開管式毛細管柱（100 m × 0.25 mm 內徑，靜相膜厚 0.20 μm），工作溫度為 150ºC，載流氣體為 H2，線性流速為 25 cm/s，偵測器為火焰離子偵測器。 P.457
計畫升溫法 圖 18-24 所顯示的是對於從沸點 69ºC 的 C6H14 到 356ºC 的 C21H44 的非極性混合物以計畫升溫 法分離的效果。 P.459-460
圖 18-18 圖18-24 以 (a) 等溫與 (b) 計畫升溫方式分離直鏈烷類，所使用的管柱為填充式非極性管柱。(a) 的偵測靈敏度比 (b) 高 16 倍。 P.459
18-7 古典液相層析法 靜相 溶劑 對於吸附型層析來說，氧化矽（SiO2．xH2O； 也稱為矽酸）是常用的靜相之一。 在吸附型層析中，溶劑與溶質互相競爭吸附在 靜相的活性位置。 不同溶劑之間對於從管柱中沖提出特定溶質的 能力與溶質的本質無關。 P.466
圖 18-22 圖18-31 溶劑分子與溶質分子對靜相上發生作用力的位置互相競爭。 溶劑分子與靜相的作用力越強，沖提強度也越大。 P.466
18-8 高效能液相層析法 高效能液相層析法（high-performance liquid chromatography； HPLC）利用高壓將沖提溶劑推入填充微米級靜相顆粒的管柱中， 這些微米級的靜相顆粒提供了非常良好的層析分離。 在圖 18-32 中的分析級 HPLC 設備所使用的管柱內徑約在 1-5 mm 而長度在 5-30 cm，理論板數為每公尺 50,000 至 100,000 板數。 P.468
圖 18-23 圖18-32 連接質譜儀作為偵測器的高效率液相層析儀（HPLC）。右圖為管柱放大圖。實際操作時，管柱烘箱會關上，才能維持固定溫度。 P.468
液相層析質譜法 電噴灑法（electrospray）是一種成功的應用技術。這種方式藉著 高電壓方式讓移動相變成霧狀由噴口噴出。 另外一種將沖提物導入質譜儀中的方式為大氣壓化學游離法 （atmospheric pressure chemical ionization），見圖 18-44。 圖 18-45 是經由質譜儀以選擇離子反應法測定所得到的層析圖。 P.476
圖18-51 圖18-44 大氣壓化學游離裝置在液相層析管柱與質譜儀之間的介面。藉由噴霧口的氣體與加熱器產生霧狀氣溶膠。由針尖的電子環形暈所放出的電子可以將分析物變成離子狀態。 P.477
親水性作用層析 親水性作用層析（Hydrophilic Interaction Chromatography；HILIC）應用在分離那些極性 太高以至於逆相層析無法滯留的分子。 圖 18-46 顯示抗壞血酸（維生素 C）與異抗壞 血酸的層析分離圖譜，兩者在結構上只有在一 個碳（C5）有差別。 當溶液 pH 7 時，胺基會完全質子化。移動相為 90：10（體積/體積）乙腈與含 0.1 M 醋酸氨的 水溶液，圖 18-47 顯示，當乙腈的含量增加時， 化合物的滯留時間會增加，這個行為與逆相層 析的趨勢相反，在逆相層析中，乙腈含量增加 滯留時間會縮短。 P.477-478
圖18-51 圖18-46 以親水性作用層析分離抗壞血酸與異抗壞血酸。以表 18-4 的胺基鍵結管柱做為分離靜相，移動相組成為 90：10 乙腈：H2O（含 0.1 M 醋酸銨）。 P.479
薄層層析法
彩色插圖 19 彩色插圖 19 薄層層析法（18-1 節）。(a) 溶劑上升通過靠近底部的染料混合物，平板上塗佈有吸附劑。(b) 當溶劑上升至接近平板頂端時，完成分離過程。