EGFR突变检测 王 婧

主要内容 EGFR突变的概念 EGFR突变的检测方法 EGFR突变的意义

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EGFR表达 EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，其表达率在NSCLC中大约占80％。

NSCLC中EGFR常见突变类型 经典突变 EGFR酪氨酸激酶区域重要的突变 G719X 点突变 (外显子18) 插入突变 (外显子20) III IV II I EGF EGFR 二聚体 细胞外 EGFR酪氨酸激酶区域重要的突变 G719X 点突变 (外显子18) 插入突变 (外显子20) E746–A750缺失突变(外显子19) L858R 点突变(外显子21) 细胞膜 经典突变 细胞内 Interest in predictive testing for clinical outcomes with TKIs was fuelled by the discovery in 2004 of somatic mutations in the EGFR gene, in a proportion of patients with NSCLC.1,2,3 The mutations were found in the region of the gene that encodes the TK domain of the EGFR receptor. The mutations seem to be most common in women who have never smoked, and less common in Caucasian than Asian populations. The results also suggested that patients with missense mutations and deletions in the EGFR TK domain were more likely to respond to EGFR TKIs, particularly gefitinib. Overall, 81% of those with responses (to either Tarceva or gefitinib) had EGFR mutations, whereas none of those who failed to respond had a mutation.1,2,3 Gene mutations can be detected by direct DNA sequencing, which is a method of determining the sequence of nucleotide bases [adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T)] in a gene. Sequencing by hybridisation based on the polymerase chain reaction (PCR) is a second method. This method allows the detection of a specific mutation due to differences in the hybridisation temperatures of small DNA fragments (hybridisation probes) between mutated and non-mutated sequences. EGFR突变的检测：测序法：灵敏度只有30%（即大于30%以上的突变才能测出来），而DHLC法灵敏度高，大于6%以上突变都能测出来。 1. Lynch TJ, et al. N Engl J Med 2004;350:2129–39. 2. Paez JG, et al. Science 2004;304:1497–500. 3. Pao W, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:13306–11. EGFR磷酸化后激发下游信号通路 Mitsudomi T, et al. Int J Clin Oncol 2006;11:190–8

EGFR突变 EGFR状态：野生型，突变型。 EGFR突变型：结构和功能发生改变；临床上突变型预测EGFR TKI的疗效。 Giacone.G.J Clin Oncol.2005:23:3235-42

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EGFR 突变检测流程 标本采集及病理评估 DNA 抽提及质控 EGFR突变检测 基因芯片 测序法 荧光定量PCR技术 检测报告

用于EGFR突变检测的标本 肿瘤组织—目前最可靠的标本 其它样本： 外周血（血浆、血清） 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刷检物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用 In particular, blood based (serum/plasma) testing is particularly attractive due to the ease of accessibility to samples, but the sensitivity of the methods currently used mean that identifying EGFR mutation positive patients from blood is still challenging • AstraZeneca research suggests that of the patients who are identified as mutation positive by analysing their tumour, approximately 50% can be identified as mutation positive by analysing circulating free DNA (cfDNA) in blood. Data demonstrated a 0% false positive rate. • For this reason, blood based testing may not replace biopsy-based testing in the near future. However, it could be used in addition to biopsy testing, for those patients for whom the physician does not have access to a sample 9

NSCLC组织取样 获取肿瘤样本的三种方法 石蜡包埋组织 组织块0.5*0.5*0.5（cm），组织包于蜡块正中央 石蜡组织切片 开胸切除 支纤镜活检 (中央型) 针刺活检 (外周型) 石蜡包埋组织 组织块0.5*0.5*0.5（cm），组织包于蜡块正中央 石蜡组织切片 石蜡切片，5-10张，6mm*6mm，5-10um厚度 石蜡组织白片，10-15张，10mm*10mm，5um厚度

EGFR该检测什么？ 检测类型 检测标的 预测作用 作用机制 参考文献 IHC-免疫组化 蛋白表达 可疑 不代表EGFR活化与否 SATURN FISH-荧光原位杂交 基因拷贝数 不确定 不代表EGFR活化与否，只是部分可能拷贝数↑和突变重叠 INTEREST、TRIBUTE、IPASS Mutation-基因突变 基因序列 确切 突变→EGFR信号通路的活化 NCCN、DING、IPASS、SATURN等

突变主要发生人群：亚洲人（50%）、女性、腺癌（特别是非粘液性）、不抽烟者 EGFR突变类型与特罗凯疗效 报告解读 突变1 突变2 特罗凯作用 占比 （亚洲人） Ex18 G719X ±其他突变 敏感性↑↑ 　5% Ex20 T790M +Ex19缺失或+Ex21 L858R 敏感性↑ -其他突变 耐药性↑ 　<3% Ex19缺失或Ex21 L858R ±Ex19缺失或±Ex21 L858R 敏感性↑↑↑ 　>90% In1 CA(n) 重复≤16 +Ex19缺失或Ex21 L858R 　10-20% 突变主要发生人群：亚洲人（50%）、女性、腺癌（特别是非粘液性）、不抽烟者 浙江省检测标准收费：￥3000（￥600/位点）

基因突变对检测技术的高要求 正常、肿瘤细胞混杂 正常、突变基因混杂 样本的复杂性——新鲜组织/石蜡包埋组织、外科手术标本、穿刺活检测标本、脱落细胞、胸腹水、外周血液、原发灶和转移灶等；突变基因含量极低。 灵敏度：100个DNA分子中检测出最低的突变数量。 特异性/准确性：检测准确率-假阳性情况。 正常、肿瘤细胞混杂 灵敏度 VS 特异性 如何解释部分机构检测结果与临床不符? 部分检测机构为更广泛推广其检测产品，不惜使用低成本设备和不稳定的检测方法，结果导致临床医生和学术界的质疑。 正常、突变基因混杂

DNA测序法>>PCR法、芯片法等 DNA测序技术包括传统Sanger测序法、焦磷酸测序法等新一代测序技术 焦磷酸测序原理 基因突变准确度/特异性： DNA测序法>>PCR法、芯片法等

环形、蝎形、PNA-LNA clamp探针等 两类突变检测技术准确性比较 类型 检测技术 检测原理 达到目的地方式 PCR ARMS 指数扩增-间接法 突变：1-2-4-8-16- 杂合：1-2-4-8- 野生：1-2- 影响因素较多、不易控制 环形、蝎形、PNA-LNA clamp探针等 测序 Sanger测序 直接检测4种核苷酸顺序： A、T、C、G 影响因素可控 焦磷酸测序 其他新一代测序 下一代测序 导航失灵、人为误差等易导致偏离航线 既定的轨道、不跑偏

COLD-PCR——低变性温度扩增突变富集技术 杂合子 野生纯合子 COLD-PCR富集突变灵敏度至0. 5%以下 COLD-PCR比常规PCR-HRM法灵敏度提高了10-20倍 原理：错配碱基（突变-杂合）的双链DNA熔解温度会降低 2008年，开发COLD-PCR结合Sanger测序法，提高了突变检测灵敏度。 微量突变检测

2011年，迪安首度开发以COLD-PCR结合焦磷酸测序技术 使基因突变检测灵敏度提高到0.5%。 新一代独创技术 PCR→ 5% Cold-PCR → 1% Cold-PCR → 0.5% Qiagen PyroMark® Q96 ID EGFR-Ex19 Del

检测报告

迪安诊断(300244)简介 公正— 独立第三方 专业提供临床检验与病理诊断服务 在全国9个城市有合法检验资质 首批通过行业最高质量体系标准-ISO15189认可 唯一拥有司法鉴定资质的独立实验室 开展项目最多；技术平台最齐备；灵敏度、特异性最好；适用样本最广；提供物流服务、临床药理学、分子诊断整体解决方案。

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“突变”的发现 J Guillermo Paez 《科学》杂志 2004年 Thomas Lynch 《新英格兰医学杂志》

EGFR突变意义的明确：从现象到本质 初显 探索 本质 现象 ISEL. BR21. IDEL. IPASS. INTEREST. TRUST. NEJ002. WJTOG3405. OPTIMAL. EURTAC. 本质 现象

特罗凯突变人群临床研究 西方数据——西班牙研究 东方数据——OPTIMAL研究

SLAG：西班牙研究 2005.4 – 2008. 12 西班牙43个中心 入组2105例 IV期NSCLC 未化疗或曾化疗 取得肿瘤和血清标本 EGFR基因检测（在同一家中心实验室） 19外显子：D746-750 21外显子：L858R 特罗凯 150mg/d治疗 存在突变者 该研究在西班牙43个中心入组了2507例IV期非小细胞肺癌患者，入组时间为2005年4月-2008年12月，并取得这些患者的标本。 对这些标本进行检测，主要是筛选19外显子和21外显子突变的患者，接受特罗凯治疗。 B. Massuti . et al, J Clin Oncol 27:7s, 2009 (suppl; abstr 8023)

PFS与OS Second-line Second-line First-line First-line Line of therapy Median PFS (months) First Second 14.0 13.0 Line of therapy Median OS (months) First Second 28.0 27.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Probability Second-line Second-line First-line First-line 0 12 24 36 48 0 12 24 36 48 Time (months) Time (months) Rosell, et al. NEJM 2009

R Optimal 研究设计 特罗凯150mg/天 直至进展 未经化疗IIIB/IV期NSCLC EGFR基因突变 (外显子 19或L858R) ECOG PS 0–2 N=165 含铂双药化疗 R 1:1 分层因子 突变类型 组织学 吸烟状态 主要终点：无进展生存(PFS) 次要终点：总生存 (OS), 客观有效率 (ORR), 疾病进展时间, 有效持续时间，, HRQoL (FACT-L, LCSS), 生物标记分析 疗效评价 每6周 Act Mut+ = activating 突变s; ECOG = Eastern Cooperative Oncology 组; PS = performance status HRQoL = health-related quality of life; FACT-L = Functional Assessment of Cancer Therapy-Lung; LCSS = lung cancer symptom scale Zhou, et al. ESMO 2010 26

OPTIMAL study ： Progression-free survival 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Erlotinib (n=82) Gem/carbo (n=72) HR=0.16 (0.10–0.26) Log-rank p<0.0001 1-ys 56.9% PFS probability 1-ys 1.7% 4.6 13.7 0 5 10 15 20 25 Time (months) Patients at risk Erlotinib 82 70 51 20 2 0 GC 72 26 4 0 0 0

特罗凯组96%的 患者 疾病控制 (CR, PR或SD) 最佳肿瘤应答: OPTIMAL 100 83% 80 RR 60 p<0.0001 患者 (%) 40 CR/PR 36% 20 CR/PR 特罗凯 (n=82) Gem/carbo (n=72) 特罗凯组96%的 患者 疾病控制 (CR, PR或SD) Zhou, et al. ESMO 2010

总结: OPTIMAL 对于 EGFR活化 突变的NSCLC患者，特罗凯是高效一 线治疗药物 中位PFS延长三倍 (13.7 月 vs 4.6 月) 特罗凯治疗疾病进展和死亡风险降低84% (HR 0.16) 各亚组（组织学 、吸烟史、年龄、性别、疾病分期） 特罗凯一线治疗均有获益 除了皮疹 (大部分为轻到中度)，特罗凯严重不良反应较化疗少

2011NCCN指南： 非鳞癌一线治疗：EGFR 突变型 EGFR mutation discovered prior to first-line therapy Second-line therapy Erlotinib Progression EGFR mutation discovered during chemotherapy Add erlotinib to chemotherapy or Switch maintenance: erlotinib Second-line therapy Progression Adapted and simplified from NSCLC NCCN Guidelines (version 3.2011)