SVZ神经干细胞和祖细胞 杨辉 刘仕勇 新桥医院神经外科

神经干细胞是近年来神经科学研究的亮点之一。在此领域取得的一系列突破性进展正在改变人们的传统观念： 1）在成年哺乳类动物脑内分离了具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，改变了成年个体神经组织不可再生的传统观念； 2）神经干细胞和其他成体干细胞的跨系诱导转变，不仅更新了成体干细胞的既往概念，而且为解决目前移植中面临的主要问题----免疫排斥开拓了新的思路；

3）放射状胶质细胞和SVZ区胶质细胞也可产生神经元，引发了人们对胶质细胞的重新认识； 此外借助于体外或体内神经干细胞模型结合分子生物学、细胞生物学等技术手段在神经发育的分子机制也取得了重要成果。

神经干细胞不仅存在于发育中的哺乳动物神经系统，而且还存在于成年动物神经系统，其中，位于侧脑室附近的室管膜下层（SVZ）和海马是目前公认的成年个体神经干细胞最为集中的地方。此两区域神经干细胞最大的区别在于海马神经干细胞不能长距离迁移，而位于SVZ的神经干细胞产生的祖细胞可以长距离迁移，这使得SVZ神经干细胞区别于海马神经干细胞成为研究神经细胞增殖、迁移和分化的最佳模型 。

一、SVZ干细胞和祖细胞概述

哺乳类新皮质神经元起源于端脑脑室层（VZ），脑室腔壁神经上皮经过不断增殖形成6层结构，依次为VZ、SVZ、中间层、皮质板下层、皮质板和缘层，出生后保留了SVZ，并维持终生。 SVZ为胼胝体以下环绕侧脑室外侧壁的薄层条带状结构，侧脑室前角的最前部也属于SVZ。据其位置关系和细胞特性，有人将出生后的SVZ分为室管膜前下区（ SVZa）和室管膜后下区（SVZp），SVZa 和SVZp尚无准确的解剖学分界。

SVZa位于SVZ的前部，此区神经干细胞在出生后产生将分化为神经元的祖细胞，沿着一条高度局限化的迁移通道-嘴侧迁移流（RMS）以链式模式朝嗅脑迁移，在嗅脑的中央区分别朝周边的颗粒细胞层和球周细胞层迁移而到达各自终点，分化为颗粒细胞和球周细胞，其中大约30%的球周细胞属于γ-氨基丁酸能神经元，70%的球周细胞属于多巴胺能神经元。 SVZa产生的祖细胞是SVZ区细胞中最具特色的细胞群：

1）自产生起即具备发育为神经元的潜能，为目前体内发现的位置最明确、成分最简单的神经元祖细胞群； 2）迁移路径固定，高度局限化，迁移目标明确，在迁移过程中始终维持神经元分化潜能但不进一步分化； 3）迁移方式主要为切线迁移，不需要放射状胶质细胞的引导。

尽管SVZ在不同种属的动物间存在较大差异，但目前在许多哺乳类动物均已证实存在SVZ，如在啮齿类动物大鼠和小鼠、灵长类动物猴等，在人类亦存在SVZ。相对于啮齿类动物，灵长类动物的嗅球已经退化，RMS退化为嗅束，因此出生后SVZa的祖细胞是沿嗅束迁移到嗅球。Kornack发现猴SVZ祖细胞的迁移方式与大鼠相同，但迁移速度明显减慢，迁移路径也较长，因而到达嗅球的时间至少需要75天（大鼠为2周）。

二、SVZ细胞构筑

以大鼠为例介绍SVZ细胞构筑： SVZ在光镜下为室管膜下明暗相间的细胞成分组成，至少含有A、B、C、E四类不同形态学表现、电镜结构和免疫学特征的细胞群，尚可见少量D细胞（Tanycyte细胞）、小胶质细胞和一些致密细胞。现介绍如下：

A细胞：光镜下颜色较暗，胞体较小，1-2个突起，2-4个小核仁，染色质分散，胞浆疏松，含较多游离核糖体。细胞外形较为平滑。TuJ1、PSA-NCAM、Vimentin和Nestin阳性，GFAP阴性。分裂增殖能力较强。 B细胞：较A细胞大，颜色较亮，不规则外形，游离核糖体少，富含中间丝，胞质致密。GFAP和Nestin染色阳性，Vimentin弱阳性，PSA-NCAM和TUJ1染色阴性。

C细胞：胞体较A、B均大，外形较平滑，染色质松散，核呈网状，折叠明显，胞质游离核糖体较少，无明显中间丝。Nestin和Vimentin染色阳性，GFAP、 PSA-NCAM、TUJ1阴性。分裂增殖能力较强。 E细胞：即室管膜细胞，形成单层细胞与室腔相隔，相邻细胞间犬牙交错，有微绒毛。胞质和染色质均疏松。Nestin和Vimentin染色阳性，GFAP弱阳性，PSA-NCAM、 TUJ1阴性。分裂增殖能力弱。

染色后采用电子计算机重建显示，A细胞呈首尾相接的链状方式穿过SVZ与RMS中的链状细胞相延续，被B细胞包围，其中B1细胞位于室管膜侧，B2细胞位于脑实质侧，C细胞多成小团状分布，部分细胞群与A细胞链相接触，接触处B细胞消失，E细胞则位于脑室腔内表面。Alvarez-Buylla对上述形态学、电镜和免疫学特点结合计算机重建结果进行分析后认为，A细胞即为神经元祖细胞，形成链状结构向RMS和嗅脑迁移，B细胞为星形胶质细胞，包绕A细胞。

C细胞可能为干细胞，因其分裂产生A细胞，经由A细胞链与C细胞相接处进入A细胞链，且表达Nestin和Vimentin等干细胞和祖细胞标志物，具有网状细胞核、中间丝缺如等未分化细胞特征。但C细胞并不是处于发育最早阶段的神经干细胞，其来源尚存在争议，有人认为来源于脑室内表面的E细胞，但Doetsch等经实验后认为其并非来源于E细胞，而是来源于SVZ中的B细胞（胶质细胞）。

三、SVZ干细胞和祖细胞的增殖、迁移和分化机制

（一）胶质细胞在SVZ神经干细胞和祖细胞增殖迁移中作用 SVZ中星形胶质细胞（B细胞）本身可能就是干细胞，在Ara-C除去SVZ中A细胞和C细胞后，2天即可重构C细胞，2周后重现A细胞链。由于SVZ星形胶质细胞具有典型的胶质细胞特征，包括形态学、超微结构和免疫学等方面特点，因而这种SVZ中出现的双重性质的B细胞究竟是因为SVZ星形胶质细胞本身就是神经干细胞抑或为星形胶质细胞向神经干细胞的逆向诱导尚不清楚。

Lim采用共培养体系发现纯化的星形胶质细胞可以促进SVZ神经干细胞和祖细胞的增殖。在哺乳类动物SVZa区到嗅脑的迁移路线上，神经元祖细胞链被“星形胶质细胞鞘”包围，链状带中的祖细胞能迁移相当长的一段距离，但并不突破周围的星形胶质细胞而侵犯脑实质，这些星形胶质细胞除可能作为干细胞产生C细胞和A细胞外，它们在SVZa祖细胞迁移过程中的作用尚不清楚。有人推测其可能参与了祖细胞的引导信号，并为神经元迁移提供营养支持。

但较多证据显示，在早期发育阶段和出生后的早期，祖细胞链中并没有胶质细胞的参与，只是后来才有星形胶质细胞的出现，因此Law认为祖细胞的迁移并不需要星形胶质细胞信号的引导，星形胶质细胞可能只起支持营养作用。令人惊奇的是，在通常情况下SVZa祖细胞并不向比嗅脑更近的其它区域如纹状体等区域迁移，因此有人推测祖细胞链周围的星形胶质细胞鞘还具有物理阻隔作用，即阻止鞘内细胞向鞘外迁移。

（二）胞外信号在SVZ神经干细胞和祖细胞增殖过程中的作用 丝裂原信号在增殖过程中起着相当重要的作用，如EGF、bFGF和TGF-α 等。在体外细胞培养中，丝裂原信号能使SVZ干细胞不断增殖。在体内实验中，注射EGF等到SVZ后分离的神经干细胞克隆的数目也有显著增加。使用不同丝裂原生长因子从SVZ分离的神经干细胞系的属性并不完全相同,如bFGF可以分离处于较早时期的神经干细胞，且其相对于EGF分化为神经元的数目明显增加。

细胞的增殖与细胞周期关系密切。在SVZ和RMS发现有两种细胞周期调节子的表达，p19INK4d主要表达于RMS和嗅脑中,而SVZ表达较低，p27Kip1则主要表达于SVZ区。已有较多证据表明SVZ和RMS 中不同的细胞类型有不同的分子机制调节细胞周期, p27Kip1主要调节C细胞的细胞周期,而p19INK4d主要调节A细胞的细胞周期。此外，调控SVZ神经干细胞和祖细胞增殖的胞外信号尚可能包括骨形成蛋白家族（BMP）、EphB2等。

（三）SVZ神经干细胞和祖细胞的迁移调控 神经细胞黏附分子是人们最早注意的可能参与迁移的黏附分子。Ono等发现SVZa祖细胞迁移过程中需要神经细胞黏附分子的一种亚型—PSA-NCAM， PSA-NCAM特异性地表达于SVZ和RMS的A细胞，除去PSA后小鼠 SVZa区神经元堆积明显，而嗅脑则发育不全。最近有研究表明如果A细胞缺乏PSA将减慢迁移速度，A细胞链并不消失 。

另一个细胞黏附分子是神经胶质黏附分子（NgCAM），使用抗NgCAMFab会破坏SVZ祖细胞的迁移。细胞黏附因子的另一家族整合素家族也参与了A细胞链的迁移，但似乎不影响A细胞迁移方向的决定，只影响A细胞的迁移动力学。正常SVZ祖细胞的迁移速度在80--120μm/hr之间，RMS在30μm/hr左右，使用整合素的抗体封闭后祖细胞的迁移速度减慢到对照组的20%-30%，但A细胞链仍然存在，迁移方向亦不改变。

Reelin是另一个整合素配体，它与α3亚单位结合启动蛋白激酶而发挥其生物学特性。reelin基因敲除小鼠SVZ迁移到嗅球的细胞明显减少，移植转染reelin基因的祖细胞到SVZ后可以迁移到嗅球，而移植未转染reelin的祖细胞则不会迁移。在体外培养神经干细胞发现，reelin对干细胞的迁移也起着相当重要的作用

迁移方向的决定可能是由多种因子决定。在SVZ和RMS已经证实一些轴突导向因子在祖细胞迁移方向的决定中起重要作用,netrin家族就是其中之一。netrin-1产生于嗅球僧帽细胞,netrin受体neogenin和DCC则高度表达于E15—P5 SVZ到嗅球的迁移流中，嗅球产生的netrin-1呈浓度梯度分布于迁移路线上吸引祖细胞的移动。采用抗DCC抗体则干扰了神经祖细胞的迁移方向，其迁移方向呈杂乱无章向各个方向迁移。

Slit蛋白是决定祖细胞迁移方向的另一因子，它产生于SVZ Slit蛋白是决定祖细胞迁移方向的另一因子，它产生于SVZ a尾侧的一些相邻结构，如脉络丛等，因而它可能是一种迁移抑制因子，阻止祖细胞向A细胞链的尾侧迁移，从而间接地推动祖细胞向前移动。由于祖细胞和轴突以“阿米巴样”运动方式迁移，一些微管相关蛋白在祖细胞的移动中起着独特的作用,如Doublecortin和collapsin resonse-mediate protein-4，就较早地表达于SVZ和RMS中。

（四）SVZ神经干细胞和祖细胞的分化 自身基因调控和外来信号调控是目前神经干细胞分化研究的两个方向。将异源性神经干细胞（如脊髓）移植到SVZa后，迁移到嗅球的神经细胞分化表型发生了变化，它们不仅保持了原有的神经细胞表型，部分神经干细胞却获得了嗅脑GABA能神经元表型，这说明异源的神经干细胞在发育过程中受到了自身基因和外来外来信号的影响。

在损伤、缺血、某些疾病等情况下，SVZ神经干细胞可以增殖迁移到损伤区域，并在外来信号的诱导下部分地分化为损伤区域神经细胞，部分地替代缺失神经细胞的功能，如在脱髓鞘白质区域，SVZ干细胞迁移到脱髓鞘区域后部分细胞分化为少突胶质细胞。此外，使用一些成熟或非成熟神经细胞的条件培养液也可以诱导干细胞的分化，并推测可能是由于培养液中含有神经细胞释放的多种已知或未知信号协同诱导所致。

在众多的外来信号中，包括神经营养因子在内的细胞因子的作用是肯定的。首先，人们在发育中的胚胎和出生后的SVZ、RMS和嗅脑均检测到了多种细胞因子及其特异性受体，且在发育过程中发生剧烈的变化，但都与神经发生同步，具有次序性，提示其与神经发育有关。其次，在大量诱导实验中发现它们增加能某些成熟神经细胞的分化，使用抗体则可以阻断这种诱导。同时转基因动物或突变体的研究中亦表明某种神经营养因子的缺乏能导致某些正常神经细胞的减少 。

自身基因信号在SVZ干细胞分化过程也起着重要的作用。自身和邻近的干细胞和祖细胞可以产生信号调控其分化，有证据表明神经细胞发育的多样性可能与干细胞表达多种多样的转录因子有关，这也是目前研究的热点之一。bHLH转录因子家族，如Mash1、Ngn1蛋白等就是其中的重要蛋白，SVZ和RMS祖细胞均表达Mash-1蛋白，但在祖细胞到达嗅球后消失，显示其与嗅球神经元分化高度相关。

多种同源盒基因分泌的同源域蛋白也参与了神经元细胞类型的决定，Pax（如Pax-6）、Dlx（如Dlx-1和Dlx-2）、Emx（如Otx-1和Otx-2）等同源盒基因就是其中的代表[26]。此外，神经发育的次序性似乎也是由干细胞自身决定的，通过受体表达的次序性在特定的时间只接受特定的信号从而引起特定的生物学效应。

四、SVZ神经干细胞在中枢功能重建中潜力

同时，由于正常成年个体SVZ仍存在神经干细胞，如能将其在体诱导分化以替代上述疾病中缺乏的神经细胞，则将为神经干细胞的应用提供更为广阔的前景。此外，SVZ神经干细胞系分裂增殖细胞，适合于目前效果最肯定、方法最成熟的逆转录病毒的转染，便于体外基因操作，是基因治疗神经系统疾病的较好载体细胞。

人们发现，在嗅球每天产生的数千新生神经细胞中，仅有少部分得以存活，大部分未来得及分化就已经死亡。研究证实只有那些与僧帽状细胞和丛状细胞形成突触联系的新生细胞才能存活，这反映了嗅球颗粒细胞的选择性存活。已发现一些因素可以影响嗅球新生神经细胞的存活，BDNF、类固醇激素和鼻孔关闭等均可影响嗅球新生神经细胞的存活。了解SVZ神经干细胞后代的生存机制将为今后SVZ神经干细胞的应用提供帮助。

成年个体SVZ神经干细胞和祖细胞对疾病、损伤和应激等具有反应能力，这也是干细胞的重要属性之一。在正常情况下，SVZ神经干细胞和祖细胞仅少量增殖，沿RMS迁移到达嗅球，但在外伤、缺血、电刺激、应激等情况下能作出一系列反应，包括干细胞和祖细胞的增殖、迁移和新生神经细胞的发育成熟。同样，迁移到皮层等区域新生神经细胞也经历着大量细胞死亡，这是否也是临床上神经功能不能完全恢复的原因呢？

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