第六章 蛋白质的结构和功能

主要内容 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 化学能对蛋白质相互作用的影响——肌球蛋白与肌动蛋白

1、肌红蛋白 肌红蛋白（myoglobin，Mb）是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 1、肌红蛋白 肌红蛋白（myoglobin，Mb）是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。 肌红蛋白是由一条多肽链和一个辅基血红素构成，相对MW=16700，由153个AA残基。除去血红素的脱辅基肌红蛋白称为珠蛋白。

肌红蛋白的结构 1、肌红蛋白的三级结构 （1）长短不同的8条α- 螺旋组成； （2）80%AA处于螺旋中 （3）拐弯处为无规卷曲 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白的结构 1、肌红蛋白的三级结构 （1）长短不同的8条α- 螺旋组成； （2）80%AA处于螺旋中 （3）拐弯处为无规卷曲 （4）肌红蛋白中4个Pro 各处于四个拐弯处； （5）分子十分紧密，仅 能容纳4个水分子； （6）亲水外部疏水内部

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白的结构 2、辅基血红素 Fe原子被称为原卟啉IX（9）的有机分子固定的，共称血素（Heme），使血液呈红色。Fe有六个配位键，其中四个与卟啉的吡咯环的N原子相连。Fe2+称亚铁血红素，Fe3+为高铁血红素，只有Fe2+的蛋白才能结合氧

肌红蛋白的结构 3、氧与肌红蛋白的结合 —Fe2+与珠蛋白的93位（F8）His的咪唑基N相连； 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白的结构 3、氧与肌红蛋白的结合 —Fe2+与珠蛋白的93位（F8）His的咪唑基N相连； —当形成氧合肌红蛋白（oxy-myoglobin）时，第6个配位键与氧结合； —当成高铁肌红蛋白时，第6配位键被H2O分子占据； —在氧结合一侧有一E7 His氧结合部位形成空间位阻区

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白与氧的结合

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 Mb多肽微环境的作用 固定血红素基。 保护血红素铁免遭氧化。 为氧分子提供一个合适的结合部位。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 氧的结合改变了肌红蛋白的构型 肌红蛋白血红素与氧结合后，铁原子从离卟啉环平面上方0.055nm处，被拉到离卟啉环平面上方0.026nm处。这对Mb生物功能并没有影响，但会影响Hb的性质。

肌红蛋白氧合曲线 MbO2 Mb + O2 [MbO2] [Mb][O2] K = [Mb] + [MbO2] Y = = [O2] 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白氧合曲线 MbO2 Mb + O2 [MbO2] [Mb][O2] K = [Mb] + [MbO2] Y = = [O2] K + [O2] O2 pO2 K + pO2

肌红蛋白氧合曲线 双曲线型 Y = 0.5 p50 = K = 2.8 torr pO2 Y = O2 K + pO2 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白氧合曲线 双曲线型 Y = 0.5 pO2 Y = O2 K + pO2 p50 = K = 2.8 torr

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白氧合曲线 Hill图 logP50

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 肌红蛋白氧合曲线 静脉血中氧分压 线粒体中氧分压 2

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 2 血红蛋白

血红蛋白的结构 ◇ Hb分子近似球形；M.W.=68 000 ◇ Hb由四个亚基组成（二条α亚基和二条β亚基）； 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 血红蛋白的结构 ◇ Hb分子近似球形；M.W.=68 000 ◇ Hb由四个亚基组成（二条α亚基和二条β亚基）； ◇ α亚基（141aa）比β亚基（146aa）短，但都比肌红蛋白链（153aa）短；这主要是因为末端H螺旋比较短； ◇ 4个血红素分别位于四条多肽链的E和F螺旋之间的裂隙处，并暴露于分子表面。 ◇ Hb- α和Hb- β及Mb虽然三级结构相似，但其氨基酸序列却有很大的不同，约只有27个位置是相同的。

血红蛋白4个血红素基分别位于每个多肽链的E和F螺旋之间的裂隙处，并暴露在分子的表面。 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 血红蛋白4个血红素基分别位于每个多肽链的E和F螺旋之间的裂隙处，并暴露在分子的表面。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 氧结合引起的血红蛋白构象变化 氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 氧结合引起的血红蛋白构象变化 血红素铁0.039nm的微小位移导致血红蛋白构象的改变。

氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态。（T态和R态） 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态。（T态和R态） 脱氧血红蛋白（紧张态） 氧合血红蛋白（松驰态）

氧合导致稳定T态的离子键和盐桥的断裂，血红蛋白的氧结合过程是一协同过程。 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 氧合导致稳定T态的离子键和盐桥的断裂，血红蛋白的氧结合过程是一协同过程。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 血红蛋白结合氧的协同作用示意图

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 Hb的氧结合曲线 血红蛋白是目前了解最清楚的别构蛋白质，血红蛋白的氧合具有正协同效应，即一个O2的结合会增加同一分子中其余空的氧结合部位对O2的亲和力。Hb的氧合曲线呈S形而非双曲线形。每个血红蛋白分子有4个血红素，因此最多只能结合4分子氧，现假定O2与Hb的结合是“全或无”的现象。 Hb + 4 O2 Hb(O2)4

[Hb][O2]4 K = [Hb(O2)4] [Hb(O2)4] [O2]4 Y = O2 = [Hb] +[Hb(O2)4] 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 [Hb][O2]4 K = [Hb(O2)4] [Hb(O2)4] [O2]4 Y = O2 = [Hb] +[Hb(O2)4] K + [O2]4 P4(O2) Y = O2 K + P4(O2)

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 Hb的氧结合曲线

◇ 协同效应增加血红蛋白在肌肉中卸O2效率。 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 ◇ 肺泡中pO2=100torr, YO2=0.97 ◇ 毛细管中pO2=20torr, YO2=0.25 ◇ Hb P50=26torr ◇ Hb 0.97-0.25=0.72 Mb 0.97-0.89=0.08 ◇ 协同效应增加血红蛋白在肌肉中卸O2效率。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 Hill图

H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响 血红蛋白与O2的结合受环境中其他分子的影响，如H+、CO2和BPG等。虽然它们在蛋白质分子上的结合部位离血红素基很远，但这些分子极大的影响血红蛋白的氧合性质。这种空间上相隔的部位之间的相互作用就是别构效应（allosteric effect）。

H+和CO2促进O2的释放（Bohr效应） pH下降时，Hb的氧饱和曲线向右移动。这种pH对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为Bohr效应。 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 H+和CO2促进O2的释放（Bohr效应） pH下降时，Hb的氧饱和曲线向右移动。这种pH对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为Bohr效应。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 Bohr效应生理意义： 当血液流经肌肉时，这里的pH较低，CO2浓度较高，因此有利于血红蛋白释放O2，使组织能比因单纯氧分压降低获得更多的氧，但同时氧的释放又促使血红蛋白与H+和CO2结合，以补偿组织呼吸引起的pH降低；当血液流经肺时，由于氧分压高有利于血红蛋白与氧的结合因此而促进了H+和CO2的释放，同时CO2的呼出又有利于氧合血红蛋白的生成。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 Bohr效应示意图

BPG降低Hb对O2的亲和力 BPG是Hb的一个重要别构效应物。Hb四聚体分子只有一个BPG结合部位，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。 蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 BPG降低Hb对O2的亲和力 BPG是Hb的一个重要别构效应物。Hb四聚体分子只有一个BPG结合部位，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。 BPG和两个β链之间的离子键有助于稳定去氧形式（T态）的血红蛋白构象，促进氧的释放。 人的某些生理性和病理性的缺氧可以通过红细胞中BPG浓度的改变来调节对组织的供氧量。 胎儿红细胞中Hb F与BPG结合力比Hb A弱，这有助于胎儿从母体获得O2。

Hb和两个β亚基之间的离子键结合

BPG和二氧化碳对Hb氧合曲线的影响

BPG对Hb氧合曲线的影响

胎儿和成人的血红蛋白氧合曲线

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 镰刀状细胞贫血是分子病 镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 病因： 患者的二条β 链上的N-末端开始的第6位Glu被Val所取代。Hb-S 比 Hb-A负电荷减少，即电泳时向正极移动的速率下降。从三级结构上看，由于β6glu位于分子表面，因此HbS表面多了一疏水侧链，血红蛋白的对氧亲和力和别构性质并不受此影响，但这一变化显著地降低了脱氧血红蛋白的溶解度。疏水侧链与其互补链之间通过疏水作用而沉淀，压迫细胞质膜，使其弯曲成镰刀形状。用氰酸钾处理镰刀状的红细胞可以防止它在脱氧状态下形成镰刀状。

蛋白质与配体的可逆结合——肌红蛋白与血红蛋白 镰刀状细胞血红蛋白可形成纤维状沉淀

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig） 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）

一、基本概念 1、免疫球蛋白是指具有抗体（antibody）活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。一般情况下，免疫球蛋白指的就是抗体。 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 一、基本概念 1、免疫球蛋白是指具有抗体（antibody）活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。一般情况下，免疫球蛋白指的就是抗体。 2、抗体具有两个显著特点：高度的特异性和庞大的多样性。

4、免疫原性是指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 3、抗原(antigen, Ag)是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。 4、免疫原性是指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。 5、反应原性是指产生的抗体或致敏T淋巴细胞能与抗原进行特异性结合的免疫反应。

蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 6、既具免疫原性又具反应原性的抗原称免疫原。某种物质之所以能成为一个良好的免疫原，是因为它有特异的化学结构，这就是抗原决定簇。抗原决定簇可以与相应的淋巴细胞表面的受体蛋白结合引起免疫应答。一个抗原决定簇只能激活一种淋巴细胞(对于B细胞)只刺激产生一种类型抗体。一个抗原可以有一个或多个抗原决定簇。抗原决定簇少，抗体与抗原结合就少，往往就见不到反应。天然抗原或复杂的半抗原决定簇往往多达几十个，因此可以与很多抗体分子交互结合。

蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 7、有些分子本身没有免疫原性，不能引起免疫反应，但是如果把它们和某些载体分子，如蛋白质分子结合起来就有了免疫原性，就能使动物对这一复合分子产生特异的抗体。这种本身无免疫原性，但有反应原性，一旦把它与载体结合就有了免疫原性的物质，就称半抗原或不完全抗原。

蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 二、IgG的结构 IgG是呈Y型结构的球蛋白。

根据组成多肽链的大小可分为轻链（Light chain, L）和重链（Heavy chain, H） 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 根据组成多肽链的大小可分为轻链（Light chain, L）和重链（Heavy chain, H） —轻链：25KD，214个氨基酸残基 —重链：50KD，450-570个氨基酸残基

根据L链和H链一级结构的序列同源性可分为可变区（Variable domain, V）和恒定区（Constant domain, C） 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 根据L链和H链一级结构的序列同源性可分为可变区（Variable domain, V）和恒定区（Constant domain, C） 可变区 VL & VH 恒定区 CH1, CH2, CH3 铰链区

可变区又可进一步分为超变区（或称互补决定区）和骨架区。 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 可变区又可进一步分为超变区（或称互补决定区）和骨架区。

蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 免疫球蛋白对抗原的识别 抗体的抗原结合部位与抗原决定簇在空间结构上是互补的。多数情况下，这种互补性是在抗原结合部位与抗原决定簇靠近的过程中，通过相互影响对方的结构形成的。

蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白

抗体的抗原结合部位与抗原决定簇分子表面基团的相互作用，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用等。 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 抗体的抗原结合部位与抗原决定簇分子表面基团的相互作用，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用等。 抗原与抗体的结合需要合适的温度、pH、缓冲体系，这种结合是可逆的。

蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 磷酸胆碱与其抗体的相互作用力

免疫球蛋白的类别 根据免疫球蛋白分子结构的不同可分为5类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。 蛋白质与配体结合的空间互补性——免疫球蛋白 免疫球蛋白的类别 根据免疫球蛋白分子结构的不同可分为5类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。

IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。

6.2.5、多克隆抗体与单克隆抗体 多克隆抗体是识别一个抗原的不同部分的多种抗体的混合物。

单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞的群体（一个克隆）合成并分泌的、均一的、识别同一抗原表位的抗体。

6.2.6、基于免疫反应的生化分析方法 酶联免疫吸附测定（ELISA）：以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。

酶标仪和酶标板

基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。 根据检测目的和操作步骤不同，有间接法、双抗体夹心法、竞争法三种类型的常用方法。

                                                       ELISA的基本类型 间接法。此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。

ELISA的基本类型 双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。

ELISA的基本类型 竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。

免疫印迹测定（Western blotting）是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用电泳分离后，通过转移电泳转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。

Western blotting

免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）是利用抗原和抗体所具有的专一亲和力而设计的层析技术。抗原和抗体在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把抗原和抗体的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。