硕士生学位课程：蛋白质组学-5 候选蛋白质的验证 易发平 基础医学院生物化学与分子生物学教研室

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蛋白质组研究路线 酶解 肽的混合物 搜索引擎 Search engine 蛋白质 PMF 验证 数据库 搜索结果

RNAi实验流程

授课内容 免疫印迹法 免疫组化法 候选蛋白质的验证 免疫荧光法 下一讲 流式细胞术 蛋白质与生物大分子相互的研究 1 1 1 2 一 3 4 二

免疫印迹法 blotting 实验技术 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。

2D电泳分离蛋白质，然后转膜，特异的探针去检测 SDS-PAGE分离蛋白,转膜,尿素去除SDS,蛋白复性,特定DNA探针检测。 免疫印迹法 Southern Blotting Northern blotting Western Blotting Eastern Blotting Southwestern blotting far-western blotting 检测对象是DNA 检测对象是RNA 检测对象是特定蛋白质 检测蛋白质翻译后修饰 检测DNA和蛋白质相互作用 检测蛋白质之间的相互作用 碱基互补配对 对象已知确定 2D电泳分离蛋白质，然后转膜，特异的探针去检测 SDS-PAGE分离蛋白,转膜,尿素去除SDS,蛋白复性,特定DNA探针检测。 对象未知 与目标蛋白结合的非抗体蛋白质检测

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 基本原理 之 基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 抗原抗体之间特异的免疫反应。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 一般流程 转膜 封闭 一抗杂交 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 二抗杂交 之 一般流程 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳

免疫印迹法 成功的要素

科学的对照

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 （1） 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 （1） 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳

免疫印迹法 之 蛋白样品的制备 Western Blotting 实验技术 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 1.水溶液提取法 之 蛋白样品的制备 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 1.水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0

免疫印迹法——蛋白样品的制备 2.低温有机溶剂提取法 蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。

免疫印迹法——蛋白样品的制备 3.水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。 4. 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白

免疫印迹法——蛋白样品的制备 2-DE 分离蛋白 细胞 验证 叶绿体 protein 鉴定 细胞膜 病 毒 2-DE

免疫印迹法 重组蛋白的特点 目的蛋白质的量较多，至少占总蛋白量的1%，常为5%-9%，使纯化易于进行。 可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有tag的DNA序列。

免疫印迹法 重组蛋白的特点 包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。 分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。

免疫印迹法 之 蛋白样品的定量 Western Blotting 实验技术 之 蛋白样品的定量 生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。

免疫印迹法—蛋白样品的定量 紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，因此A280值不同。 Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。

免疫印迹法—蛋白样品的定量 凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出蛋白的含量。 福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。

免疫印迹法—蛋白样品的定量 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。） 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 ddH2O 90 50 55 60 65 70 75 80 85 蛋白标准液 40 35 30 25 20 15 10 HCl

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 蛋白样品的制备 SDS-PAGE 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 SDS-PAGE （2）

Western Blotting 实验技术 之 SDS-PAGE

免疫印迹法 SDS-PAGE 原理 蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。 SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的SDS结合后，各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。

免疫印迹法 SDS-PAGE 凝胶成份 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）  聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及Bis的浓度决定。Bis一定的情况下，总浓度越高，孔径越小。

免疫印迹法 SDS-PAGE 凝胶成份 TEMED 过硫酸铵（APS）(时间) 配胶的Tris缓冲液 Tris-甘氨酸电泳缓冲液

免疫印迹法 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212

免疫印迹法 浓缩胶浓缩蛋白质的原理 在不连续SDS-PAGE时,采用了两种缓冲液浓度、pH值和凝胶孔径，上层胶为浓缩胶（大孔径），下层胶为分离胶（分子筛）。 浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳Buffer的缓冲对为Tris-甘氨酸。电泳时，胶中的Cl-移动最快， 电泳缓冲液中的甘氨酸（pI为6.0）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动最慢。而SDS-Protein 在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移动速度居第二。即泳动速度为Cl- >蛋白>甘氨酸离子。

免疫印迹法 浓缩胶浓缩蛋白质的原理 随着电泳的进行， Cl-与后面的蛋白带之间形成电势梯度，同样的蛋白与甘氨酸离子之间也会形成电势梯度。高电势使蛋白质和甘氨酸离子的移动速度加快，形成一个迅速移动界面。由于蛋白质的有效泳动度居第二，使蛋白质聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一狭窄的中间层。所以，加样后，通过此浓缩过程，都能形成一狭窄的区带。

免疫印迹法 SDS-PAGE 电压设置 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

免疫印迹法 SDS-PAGE 预染标准蛋白 **预染蛋白质分子量标准包含了从19kD到117kD共6种纯化的预染蓝色蛋白质，可以直接使用，无需煮沸。每次上样5-10微升，就可以在电泳时、电泳后或转膜后观察到非常清楚的蛋白条带。

免疫印迹法 SDS-PAGE 注意事项 1）电压。小的电压会使胶的分子筛效应得到充 分发挥，电压越小，条带越漂亮。

免疫印迹法 SDS-PAGE 注意事项

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 （3） 封闭 一抗杂交 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 （3） 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳

Western Blotting 实验技术 之 转膜 （尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ） 价格便宜 硝酸纤 维素膜 简单快速封闭非特异性抗体结合 封闭非特异性抗体结合麻烦 膜的选择 尼龙膜 价格昂贵 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ） 特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 PVDF膜 蛋白结合量最高，机械强度也高，其上的蛋白可用染料染色也可免疫显色，但使用前需处理。特别适于氨基酸组成分析和序列分析。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 转膜方法 半干法 之 转膜方法 半干法 按：用缓冲液湿润滤纸3张、膜、凝胶、缓冲液湿润滤纸3张顺序放置，电转10－30min。但高分子量的蛋白转移效率较低。

具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。 免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 转膜方法 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 转膜后检测 丽春红S染色 之 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次，脱色。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 （4） 二抗杂交 蛋白样品的制备 底物显色 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 （4） 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 封闭- Why? 蛋白 抗体 膜 杂交信号

免疫印迹法 之 封闭 Western Blotting 实验技术 目的：防止抗体与膜的非特异性结合。 脱脂奶粉（5％） BSA 之 封闭 目的：防止抗体与膜的非特异性结合。 脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）

封闭液选择 在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同。 牛奶封闭液可能含有能与抗山羊类抗体交叉反应的IgG, 由此产生非特异性背景。建议使用casein（牛奶中的酪蛋白）或BSA做封闭。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 封闭 蛋白样品的制备 一抗杂交 SDS聚丙烯酰胺 二抗杂交 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （5）

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 一抗杂交 之 一抗杂交 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 洗去未结合的一抗：回收一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。

回收一抗溶液 ？ 在Western或免疫荧光染色等操作后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western或免疫荧光染色时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。 回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。

一抗杂交-----一抗选择 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。

一抗杂交-----一抗选择 单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。  多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 二抗杂交 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （6）

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 二抗杂交 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 之 二抗杂交 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 洗去未结合的二抗：倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 二抗杂交 二抗算不算多余？一抗不能显色吗？ 一抗是特异性的，常用单抗。 之 二抗杂交 二抗算不算多余？一抗不能显色吗？ 一抗是特异性的，常用单抗。 二抗要求广谱抗体，最好能够一对多。 一抗如果是鼠抗人的抗体，二抗应该是另一种动物抗鼠的抗体，而且一抗和二抗的动物种属原则上不应该相同。一般来说，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 二抗杂交 之 流程详解 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （7）

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 底物显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 之 底物显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 底物显色 之 底物显色 在同一张膜上检测目的蛋白和内对照（β-actin，GAPDH ），应先上目的蛋白的一抗、二抗，显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，显色、压片、洗片。

Western Blotting 实验技术 之 底物显色 常用显色法的原理 DAB、 ECL法都能达到纳克的要求。ECL是一种增强显色法，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文章常用。 DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。

Western Blotting 实验技术 之 底物显色 常用显色法的原理 Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

免疫印迹法---成功例子 A.RT-PCR; B. Western blot C.Col I mRNA 数据分析 D. Col I蛋白数据分析

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 杂交结果的分析 之 杂交结果的分析 Western blotting 可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量和半定量分析，但是不能定位。 定量Western Blotting技术需要具备两个必要条件。其一：信号必须稳定，保证不同时间点检测都可以得到相同的结果；其二：信号的强弱必须与目标蛋白深度成比例关系。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 杂交结果的分析 之 杂交结果的分析 利用红外激光器产生的激光激发红外荧光染料，产生的发射光由高灵敏度光电二极管检测荧光信号强度。荧光信号一经激发出来就是稳定的，不随时间变化；荧光强弱与目标蛋白浓度成比例关系（浓度越高，结合的染料越多，荧光信号越强），根据荧光强弱就可以对蛋白进行精确的定量分析。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 杂交结果的分析 之 杂交结果的分析 Western blot 的半定量将图片扫描保存为电脑文件，用分析软件（如：GIS1000）将图片上每个特异条带灰度值数字化。目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH/Actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 杂交结果的分析 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会有假阳性。 之 杂交结果的分析 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会有假阳性。 免疫组化定量分析（半定量）：用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记分为0～3 分,着色深度以多数细胞呈色程度为准。常用软件进行处理，如image pro plus 5.0（IPP5）。

Western Blotting 常见问题分析 免疫印迹法 Western Blotting 常见问题分析

Western Blotting 常见问题分析 不恰当的样品制备会导致实验失败 新手采用含TritonX-100或NP-40的缓冲液裂解组织或细胞，结果无蛋白条带。因为步骤太多，新手无法保证每一步操作都正确。SDS-PAGE上样样品中蛋白实际含量较低。

Western Blotting 常见问题分析 SDS-PAGE 不完美 胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 胶不平？ 凝胶漏液？

Western Blotting 常见问题分析 SDS-PAGE 不完美 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？4，5，6，7

Western Blotting 常见问题分析 SDS-PAGE 不完美 条带1、2、3、9的形状，属电泳条件比较合适的区带，其余都是电泳条件不太理想所致。 影响区带形状因素：凝胶的孔径，样品的盐浓度，蛋白质的量（如8，量太多，带向下垂），电泳过程中产生的热，点样的位置（如在胶的左、右端的样品，因电压关系常出现歪斜），浓缩胶点样槽的底部不平也造成区带的歪斜。

Western Blotting 常见问题分析 SDS-PAGE 不完美 条带呈笑脸状 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 条带呈皱眉状， 可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

Western Blotting 常见问题分析 转膜及抗体检测 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？

Western Blotting 常见问题分析 一抗浓度影响结果 一抗浓度太高，导致没有特异带。可能与抗体-抗原结合的所谓空间位阻现象有关，也可能是高浓度抗体导致的高背景会洇灭特异信号。

Western Blotting 常见问题分析 背景太高 protein protein 背景太高 背景较浅 对比度要好。

Western Blotting 常见问题分析 背景太高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度

Western Blotting 常见问题分析 背景太高 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。 如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

Western Blotting 常见问题分析 DAB法显色中常出现的问题及对策 (1)膜干燥之后，区带颜色变浅，甚至看不见了。 原因：这是该区带的蛋白量很少所致，属正常变化。 对策：如果为了照像，可将膜浸湿，增强信号，但为 了根本解决问题，还需增加点样量。

Western Blotting 常见问题分析 DAB法显色中常出现的问题及对策 (2)膜一放入显色液中，显色液就变色，膜的背景也很深。 原因：①二抗反应后，膜洗得不干净，还有过量的过氧化物酶或碱性磷酸酶存在；②显色液的温度过高；③显色液或基质的浓度过高。 对策：①立即倒掉显色液，膜用漂洗液充分洗净之后，重新显色。但是如果背景颜色已太深，清晰的图谱已难得到；②将显色液温度降低之后，再显色；③将显色液中各成分的浓度降低，重新配制。

Western Blotting 常见问题分析 显色中常出现的问题及对策 (3)显色液没有被污染，但是区带显色迅速，颜色变黑， 显色液也变色。 原因：不是异常结果，而是区带的蛋白质含量高。 对策：将显色液稀释，使反应速度减慢，但最好是将 蛋白质点样量减少。

Western Blotting 常见问题分析 显色中常出现的问题及对策 (4)显色时间已足够长，但仍不见区带出现，显色液也澄 清不变色。 原因：①过氧化物酶或碱性磷酸酶都不存在或已失活 ②显色液有问题。 对策：①检查二抗是否有错，膜充分洗净后，用新配 制抗体反应； ②重新配制显色液。

Western Blotting 常见问题分析 显色中常出现的问题及对策 (5)显色时间已足够长，显色液已变色，但仍不见区带出现。 原因：①一抗所对应的抗原蛋白质不存在，或量很少； ②一抗和二抗都失活，或二抗不能与一抗反应。 对策：①增大电泳时的蛋白质点样量； ②分别确定一抗、二抗活性的有无。如结合反应正 常，最后测定抗体的效价。

Western Blotting 常见问题分析 不同公司的试剂结果迥然 ECL发光。背景高掩盖目的条带。失败。 同一张膜用TBS-T冲洗，再改用另外公司的ECL发光，曝光后成功。

Western Blotting 常见问题分析 杂带多的原因 1. 一抗如是多克隆抗体，可以试着降低一抗的浓度；如一 抗是单抗，可适当降低二抗的浓度 2. 最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2 小时室温封闭，时间允许可4度过夜封闭 3. 洗膜一定要充分。如是DAB 显色时间不要过长，一般2 分钟足够。 4. 细胞传代次数过多，促使其蛋白表达模式的分化。 5. 蛋白样品降解或存在二聚体。

免疫印迹法 膜上蛋白质的 其他用途 氨基酸序列分析 作为抗原免疫动物制备抗体

授课内容 免疫印迹法 √ 1 免疫组化法 2 候选蛋白质的验证 一 1 免疫荧光法 3 流式细胞术 4 1

免疫组化法 免疫组化法 之 原理及定义 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

免疫组化法 免疫组化法 之 抗体 单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。 之 抗体 单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。 多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

免疫组化法 免疫组化法 之 标本来源 主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

免疫组化法 免疫组化法 之 标本制作 石蜡切片机 冰冻切片机 U2Os细胞系APE1 免疫组化染色-细胞爬片法

免疫组化法 免疫组化法 之 主要步骤 洗载玻片 包埋组织 切片 脱蜡 抗原修复 血清封闭 加一抗 加二抗 加显色剂 复染 脱水 封片

免疫组化法 免疫组化法 之 抗原修复 ？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以在进行染色前，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

免疫组化法 免疫组化法 之 染色方法 根据标记物的不同分为 免疫荧光法 免疫酶标法 亲和组织化学法。

免疫组化法 免疫组化法 之 注意事项 1. 组织固定越新鲜越好 之 注意事项 1. 组织固定越新鲜越好 原因：坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，在产酶多的器官是比较明显的。 对策：对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

免疫组化法 之 注意事项 2. 组织脱水必须彻底干净 免疫组化法 之 注意事项 2. 组织脱水必须彻底干净 原因：组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败。 对策：取材要平整、外观好看、大小厚度适中。

免疫组化法 之 注意事项 3. 切片必须完整、均匀、平展、无邹折 免疫组化法 之 注意事项 3. 切片必须完整、均匀、平展、无邹折 原因：切片完整，平展、无汽泡，无邹折，有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一。如果有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，染色后在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性。

免疫组化法 之 注意事项 4. 切片脱蜡必须干净 原因：如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。

免疫组化法 之 注意事项 5. 彻底抑制内源性过氧化物酶的活性 免疫组化法 之 注意事项 5. 彻底抑制内源性过氧化物酶的活性 原因：各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，生成与阳性物一样的黄棕色，即背景染色造成混乱。在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。 对策：常用抑制剂是0.3%的H2O2。

免疫组化法 之 注意事项 6. 手工操作时注意抗体的正确加入 免疫组化法 之 注意事项 6. 手工操作时注意抗体的正确加入 ① PBS冲洗完毕后，加入抗体，如一抗，二抗或三抗。除去切片上多余的PBS，但不能让切片干涸。切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。切片干涸，往往可产生非特异性染色。

免疫组化法 之 注意事项 ② 加入的抗体以一滴为佳。 免疫组化法 之 注意事项 ② 加入的抗体以一滴为佳。 当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50ul为好，加入后，轻微、摇匀覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。

免疫组化法 之 注意事项 7. 选择合适的孵育时间 按说明书操作。不主张于4℃冰箱中过夜，原因是： 免疫组化法 之 注意事项 7. 选择合适的孵育时间 按说明书操作。不主张于4℃冰箱中过夜，原因是： 1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。 2.目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好　。 3.长时间孵育，容易引起切片脱落，造成染色的失败。

免疫组化法 之 注意事项 8. PBS的冲洗 免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。 ①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 ②温柔冲洗，防止切片的脱落。 ③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 　

免疫组化法 免疫组化法与免疫印迹法比较 一抗 定位 定量 假阳性 项目 方法 免疫组化 线性表位 Yes 有 构象形表位 Yes 不能 精确定量 有 Western blotting No

免疫组化法 免疫组化法 之 主要用途 对目的蛋白进行如下研究： 定位 定性 定量 棕黄色（阳性），细胞核

授课内容 免疫印迹法 √ 1 免疫组化法 √ 2 候选蛋白质的验证 一 1 免疫荧光法 3 流式细胞术 4 1

免疫荧光法 免疫荧光法 之 原理 根据抗原抗体反应，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。

免疫荧光法 荧光抗体染色 1. 直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）,荧光显微镜下观察→检测抗原。 优点：简单，时间短，特异性强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。 应用：基本不用了！！

免疫荧光法 2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。显色后镜检。 特点：较直接法灵敏； 标记一种抗体鉴定多种抗原。

免疫荧光法 免疫荧光法 之 主要用途 1. 显示目的基因的表达情况

免疫荧光法

免疫荧光法 2. 基因定位 免疫荧光法 之 主要用途 1. 显示目的基因的表达情况 免疫荧光法 之 主要用途 1. 显示目的基因的表达情况 2. 基因定位 因为较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)。

免疫荧光法

授课内容 免疫印迹法 √ 1 免疫组化法 √ 2 候选蛋白质的验证 一 1 免疫荧光法 √ 3 流式细胞术 4 1

流式细胞术 流式细胞术 之 简介 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等。 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。

流式细胞术 流式细胞术 之 实验原理 单细胞 悬液 荧光信号 激光束 磷酸缓冲液

流式细胞术 流式细胞术 之 实验原理 荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。

√ 流式细胞术 流式细胞术 之 实验步骤 ① 标本准备 自己完成 + 抗体+ 支票 样本处理 ② 别人完成 ③ 上机检测 流式细胞术 之 实验步骤 √ ① 标本准备 自己完成 + 抗体+ 支票 样本处理 细胞计数、抗体染色、孵育、溶血、固定 ② 别人完成 ③ 上机检测

流式细胞术 流式细胞术 之 样本准备 标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 标本处理时间： 流式细胞术 之 样本准备 标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 标本处理时间： 新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析。

流式细胞术 流式细胞术 之 样本准备 从组织获取淋巴细胞方法： 流式细胞术 之 样本准备 从组织获取淋巴细胞方法： 淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。 其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。

流式细胞术 流式细胞术 之 样本准备 其他类型细胞： 在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异。 流式细胞术 之 样本准备 其他类型细胞： 在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异。 许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。

流式细胞术 之 结果形式 散点图 直方图

流式细胞术 流式细胞术 之 应用领域 细胞学应用 遗传学应用 临床应用 科研应用

在上述信号基础上的细胞分选 细胞结构 细胞功能 流式细胞术 之 细胞学应用 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 流式细胞术 之 细胞学应用 细胞结构 细胞功能 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡 在上述信号基础上的细胞分选

流式细胞术 之 遗传学应用 细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 流式细胞术 之 遗传学应用 细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 报告基因的定性定量检测 植物遗传学研究

流式细胞术 流式细胞术 之 临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 流式细胞术 之 临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病

流式细胞术 流式细胞术 之 科研应用 免疫功能研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 动物性别筛选 海洋与环境微生物分析 染色体分选

流式细胞术 What can Flow Cytometer tell us about a cell? 细胞增殖（细胞周期）、细胞分裂 细胞凋亡 细胞散射光、荧光吸收、凋亡蛋白、线粒体功能、钙离子流和 pH值变化、 DNA 链的断裂、 DNA含量 免疫功能 免疫细胞亚群、细胞因子、磷酸化 端粒长度 基因转染后细胞分选

总结 免疫印迹法 √ 免疫组化法 √ 候选蛋白质的验证 免疫荧光法 √ 流式细胞术 √ 实验原理、操作步骤、注意事项、主要用途 1 1 2 免疫印迹法 √ 1 免疫组化法 √ 2 候选蛋白质的验证 1 免疫荧光法 √ 3 流式细胞术 √ 4 实验原理、操作步骤、注意事项、主要用途

谢谢大家的关注！ 2011.10.29 www.themegallery.com