基 因 治 疗 研生究教程

基 因 治 疗 原 理

上世纪中叶以来，分子生物学特别是DNA重组技术的迅猛发展，推进了整个生物学和医学领域的巨大进步，并导致了基因治疗（gene therapy）这一全新的医学治疗方法问世。

自1990年9月美国科学家Anderson等进行了首例[腺苷脱氨酶（ADA）缺陷患儿]基因治疗的临床试验开始，迄今全世界范围内已经批准近600个临床试验方案，基因治疗的对象已包括遗传病、恶性肿瘤、神经内分泌疾病，自身免疫疾病、心脑血管病、甚至艾滋病等疑难顽症。

人类基因组的DNA序列工作框架图的完成，标志着功能基因组时代的到来，人类对自身基因的功能特别是与疾病相关的基因的了解将空前加快，这对基因治疗的研究无疑会产生巨大的推动作用。我们有理由相信在不远的将来必然会产生突破性的进展，并带来具有深远意义的医疗革命，也必将对制药产业产生巨大的影响。

一、基因治疗概念和策略

基因治疗是指改变人体活细胞遗传物质的一种医学治疗方法（a medical intervention based on modification of genetic material of living cells），在基因水平上将正常有功能的基因或其他基因通过基因转移方式导人到患者体内，并使之表达功能正常的基因，或表达患者原来不存在或表达很低的外源基因，使其获得治疗效果。

基因治疗不同于基因工程药物治疗，前者是将基因重组于表达载体并直接导入患者体内，而后者是将重组基因（具有应用价值的基因即“目的基因”装配在具有表达所需元件的特定载体中）导入相应的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞，在体外进行扩增并经分离、纯化后，获得其表达的蛋白产物（如干扰素等细胞因子、生长激素等激素、链激酶等外源性酶）。

由于基因治疗的实际效果是通过基因在体内产生特定的功能分子（核酸或蛋白质），实质上可以看作是导入一个具有治疗作用的给药系统，基因可看作“药物”，有人将基因治疗制剂（或制品）称之为基因药物 （gene medicine）。

基因治疗按基因操作方式分为两类：一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。

另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以抑制某些异常基因表达。

按靶细胞类型又可分为生殖细胞 (germ-line cell)基因治疗和体细胞（somatic cell）基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子，卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。

从理论上讲，直接对生殖细胞进行基因治疗是可行的并能彻底根除遗传病，但由于当前基因治疗技术还不成熟，以及涉及一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限某一类体细胞，其影响也只限某个体的当代。

二、基因治疗步骤和方法

基因治疗是通过外源性遗传物质（目的基因）导入机体靶细胞而治疗疾病的方法。因此，基因治疗的条件包括：目的基因的准备，靶细胞选择以及基因转移（gene transfer）方法和途径。

1.目的基因的准备 基因治疗首先必须获得目的基因，并对表达调控进行详细研究 1.目的基因的准备 基因治疗首先必须获得目的基因，并对表达调控进行详细研究

根据基因治疗不同需要，目的基因可以选择互补DNA（complementary DNA，cDNA)，也可以选择染色体基因组DNA(genomic DNA)；可以是人体正常的基因，也可以是人体基因组所不存在的野生型基因。供转移的目的基因必须保持结构及功能的完整性以保证在靶细胞中正常表达其功能。

目的基因本身一般不含启动子等调控序列，导入靶细胞后很难进行表达。因此，必须将目的基因重组于含有调控序列的质粒或病毒的表达载体(expression vector)的合适位置，再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。

2．靶细胞的选择

视基因治疗目的选择不同的体细胞作为靶细胞。生殖细胞作为基因转移的靶细胞仅在动物中进行,用于建立转基因动物（transgenic animal）来生产治疗药物或疾病模型等。

基因治疗的合适靶细胞应容易从体内取出和回输，能在体外增殖并经得起体外基因操作，能高效表达外源基因以及具有较长的存活期。由于病毒载体的各个特定序列往往与特异的细胞因子结合，因而靶细胞类型直接决定载体的表达效率及存在状态。

基因治疗中靶细胞的选择现在倾向于从实际出发，即对于不同疾病的基因治疗选用不同类型的靶细胞。如以肝细胞为靶细胞治疗家族性高胆固醇血症，以中枢神经系统细胞为靶细胞治疗帕金森病。目前常用的靶细胞有骨髓干细胞、肝细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞、肌细胞和内皮细胞等。

近年来已越来越多将带外源目的基因的载体直接导人体内相应的靶组织器官，如脑、肺肝及骨骼肌等。

（1） 骨髓干细胞： 骨髓细胞是最被重视和最常用的靶细胞，有如下优点：①骨髓组织易于接受各种处理；②多年来应用自体或异体骨髓移植(BMT)治疗血液病和恶性肿瘤已累积丰富的经验；

③许多已知的遗传病都或多或少涉及到源自骨髓的细胞；④源自骨髓的细胞（如血细胞、组织巨噬细胞等）遍布全身，几乎存在于所有的器官和组织中，因而有可能应用经基因工程改造过的骨髓细胞来治疗一些并不直接与骨髓细胞有关的遗传病。

（2） 肝细胞：近年来应用微载体(microcarrier)技术克服了肝细胞不易移植的困难。用肝细胞作为靶细胞治疗人类低密度脂蛋白受体缺乏症已批准用于临床试验。其他还可治疗苯丙酮尿症，a1血抗胰蛋白酶缺乏症等代谢异常的疾病。

（3） 成纤维细胞：皮肤成纤维细胞易于取材，植入方便且体外易于培养，因而已被选用来研究血友病，血清蛋白病以及糖尿病等激素缺乏疾病的基因治疗。

（4） 淋巴细胞：淋巴细胞很易采集、分离，在体外可大量增殖。虽然其在体内存活期有限，但可连续多次输入人体内。首例ADA缺乏症基因治疗临床试验就选用淋巴细胞作为靶细胞的。恶性肿瘤基因治疗中常用肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，因其对肿瘤有特异性，转入外源基因回输病人体内理论上可重新集中分布于肿瘤所在部位。

（5） 肿瘤细胞：也是肿瘤基因治疗研究中常用的靶细胞。通过基因转移增加肿瘤细胞的免疫原性，或抑制癌基因的表达，或表达正常的抑癌基因以及自杀基因等。

3. 基因转移途径

基因治疗有两种途径: 含目的基因表达载体借助于体内（in vivo．）直接转移即一步法和回体（ex vivo）转移途径实现基因转移。前者将含有外源目的基因重组的病毒、脂质体或裸露DNA直接导入试验个体或组织内；后者是将试验对象的细胞取出，体外培养并导入外源目的基因，然后将这些遗传修饰的细胞(称基因工程化的细胞) 经体外扩增，重新回输试验个体体内。

ex vivo 基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；in vivo基因转移途径操作简便，类似传统给药方法，容易推广，这类基因转移途径目前虽然尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题，但它是基因转移的方向，只有in vivo基因转移途径成熟了，基因治疗才能真正走向临床，同时意味着基因药物时代的全面到来。

基 因 转 移 方 法

基因治疗的技术和方式日趋多样性，基因治疗能否成功很大程度上取决于能否建立一套安全、有效、简便的基因转移方法。基因转移是指用适当手段将外源目的基因导人体外或体内细胞中的分子生物学技术。常用基因转移方法大体分为非病毒介导和病毒介导两大类。

前者包括脂质体介导法、受体介导法、裸DNA直接注射法；颗粒轰击技术等理化方法，后者有以腺病毒为代表非整合型载体，以及如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体等整合型载体介导的生物方法。

逆转录病毒载体仍是目前应用最广泛、体外转基因效率最高的基因转移方法。腺病毒载体和阳离子脂质体载体越来越受到广泛重视。近年来，将上述两类方法结合起来，又发展了病毒-受体介导法，病毒-脂质体介导法等新方法。

一、非病毒介导基因转移

（一）脂质体介导法

脂质体种类较多，其中阳离子脂质体（cationic liposome）最为常用。这类脂质体由表面带正电荷的双层脂质体分子组成，它与质粒DNA（双螺旋的磷酸骨架带负电荷）自发而迅速结合形成复合体，通过带负电荷（唾液酸残基）细胞膜融合或受体介导的内吞（endocytosis）作用将质粒DNA转移入细胞。在胞浆中释放的质粒DNA转移入核内，一般以非整合方式（unintegrated form）存在。

脂质体介导的基因转移方法的优点是方法简便，可以携带较大的DNA分子，比较安全，能转染（transfection，通常指将目的基因导入靶细胞的过程）的细胞类型也较多，而且靶细胞不需要处于分裂状态（增殖细胞的转染率较高）。

（二）受体介导法

细胞表面受体与特异性配体结合后，发生内化（intemalization）或内吞，使配体转移入细胞。因此，将外源基因与配体连接，形成配体-DNA复合体，通过与相应受体结合，也可以达到向细胞转移基因的目的。

一般用多聚赖氨酸(polylysine)作为配体与DNA的交联剂。据报道应用糖化的组蛋白代替一般的糖蛋白作为配体，可以获得更高的转基因效率。受体介导的基因转移方法比较简便、安全，有些配体还有一定的细胞靶向性或其本身就有一定的治疗作用，但一般持续时间较短。

（三）裸DNA直接注射法

将外源基因插入高效基因表达质粒中，然后选择合适的方法和部位将其直接注入宿主组织或细胞中。这种质粒DNA以非整合方式存在，但能在相当长一段时间内稳定地表达所编码的蛋白质。此方法仅对具有特殊结构的肌细胞效果较好（可能与肌细胞溶酶体酶系活性很低有关），而其他组织细胞效果很差，限制其应用。

不过，若通过经此法遗传修饰的肌细胞后再行移植，可以扩大其应用。最近电脉冲介导裸DNA技术的改进使许多基因，如分泌性蛋白的基因可导入肌肉，维持相当时间的高效表达。

二、病毒介导基因转移

（一）逆转录病毒(retrovirus，RV)载体

逆转录病毒载体系统是最常使用的基因转移系统。包括重组逆转录病毒载体和包装细胞（packaging cell）两部分组成。此类载体优点是：①转染谱广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞，成肌细胞，肝细胞等；②一次可感染大量细胞，转染率高达100％；③能整合至宿主细胞基因组中，使靶细胞成为稳定表达目的基因的转化细胞，故称之为转导（transduction）

(二)腺病毒(adenovirus，AD)载体

腺病毒系引起上呼吸道蹙染的普遍双链DNA病毒。腺病毒载体主要优点是：①腺病毒在自然界中广泛存在。从许多物种可以分离到腺病毒，据报道有100多个亚型，其中有43个左右的亚型是从人体中分离到的。大多数成人接触过基因治疗中广泛应用的腺病毒载体（2型和5型腺病毒）。②与现有的其他载体相比，腺病毒载体可以快速感染大多数人体细胞，产生高水平的基因转移。

③腺病毒载体对人体致病性低，只引起极低或轻微的普通感冒相关症状。④腺病毒载体可以携带较大的DNA片段（可达7 ③腺病毒载体对人体致病性低，只引起极低或轻微的普通感冒相关症状。④腺病毒载体可以携带较大的DNA片段（可达7.5kb左右）并将之转染到非分裂细胞。⑤腺病毒基因组很少发生重组，插入的外源基因在随后的病毒复制过程中通常能够保持稳定。⑥运用重组DNA技术对腺病毒载体进行操作比较容易。

（三）腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体

腺相关病毒是一种复制缺陷性细小病毒，必须与腺病毒或单纯疱疹病毒或痘苗病毒等辅助病毒共感染时才能进行有效复制和产生溶细胞性感染。其特点是：①能特异地整合于人类第19对染色体的长臂中，从而减少重组AAV插入突变的危险性；②AAV基因组可克隆到一个质粒中，载体构建简单； ③无致病性，安全性高；④宿主范围广，可感染多种细胞；⑤稳定性好，便于浓缩、纯化和灭活辅助病毒

（四）其他病毒载体

慢病毒（ientivims）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)具有神经细胞的嗜向性，为外源基因转染于中枢神经细胞提供了一种独特方法。

三、基因转移方法评价

基因治疗应根据不同的靶细胞和细胞基因转移系统的特点来选择不同的转移方法。例如，处于分裂相的肿瘤细胞可用逆转录病毒载体转移系统；肌肉组织由于其特殊的结构，特别适用于裸DNA直接注射法等。

理想的基因治疗载体应具有以下特点：①必须易于高滴度大规模商品化生产；②载体的持续稳定性：即在一定时期内能够持续表达或者精确地调控遗传物质；③载体的免疫惰性：载体成分在导人后不激活宿主的免疫反应；④载体的组织靶向性：即载体能定向地进入特定的细胞类型；⑤载体对导入的遗传物质的大小没有限制；

⑥载体带有合适的调控序列，可以有效地转导、调节和表达外源遗传物质；⑦载体在细胞分裂中完成分裂和分泌，或者整合到靶细胞染色体特异性基因位点上，以避免对宿主染色体及生理条件下内源基因调节区域的随机整合；⑧载体对分裂和未分裂细胞的均能感染：大量细胞（如神经元，肝细胞和肌细胞），是分裂后期细胞，所以需要能够有效地转导非分裂细胞的载体。

基因治疗的有效性试验

在临床试验前，须提供基因治疗申请方案的体外及体内试验有效性的资料。

（一）体外试验 须证明该外源基因导人细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属ex vivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导入体内后预期的效果

（二）体内试验 提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径(如动脉插管)有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。若有些方案在动物中难以观察其疗效（如种族差异），应充分提供有效性的间接或旁证资料或依据。

基因治疗的前景

基因治疗从20世纪80年代起至今，经历了三个阶段：一是准备期(1980年—1989年)。这个阶段中，科学家们在临床前研究方面进行了大量工作，同时也在舆论上做了很多准备。二是狂热期（1990年—1995年）。随着1990年9月基因治疗的第一例应用获得了成功，带来了医学生物学领域的一片狂热，但由于一些关键技术还没有解决，在临床应用中碰壁是必然的。

三是理性期(1996年之后)。在对过去几年基因治疗临床试验进行初步评估的基础上，提出必须对基因治疗的关键问题进行研究，使基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道。目前采用的基因增强或基因失活方法，可以说是基因治疗迈出的第一步，有着良好的前景。

本世纪基因治疗的发展前景有学者作以下推测

1、前10年，将会有少数临床试验方案取得疗效。第一批基因治疗的产品可能上市。 2、今后20年，随着基因导入系统、表达调控元件以及新的治疗基因的发现，在恶性肿瘤等疾病中，基因治疗将会成为综合治疗的一员，对防止转移、复发可能会有其重要的地位。

3、随着电脉冲技术的完善和表达调控系统的突破，基因药物，即基因DNA通过肌肉导入而表达并分泌其蛋白产物，将成为基因工程多肽药物的重要竞争者和基因治疗延伸的重要领域。

4、随着进入细胞的寡肽的发现，不少非分泌性蛋白也将可以组建融合基因，从而通过基因工程表达，形成新的基因工程多肽药物。届时，基因治疗和基因工程的相互竞争局面将会出现。最终的结果，可能以各种基因的具体情况来判断孰优孰劣。其后果对现有的企业和投资者将会造成最大动荡，但最后得益者都是临床病人，这毕竟令人欣慰。

尽管目前对于基因治疗还有许多技术难题有待解决，但可以相信：随着破译人体数万个基因的全部核苷酸序列及搞清它的结构和功能的人类基因组计划（human genomic project，HGP）的完成、基因表达调控机制的阐明以及基因转移技术的发展和完善，基因治疗必将成为本世纪人类攻克疑难病的一种常规治疗手段。