第四章 荧光分析法 第一节 概述 一．定义和分类 （1）定义：物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态 第一节 概述 一．定义和分类 （1）定义：物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态 的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光，根据物 质的光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法 称为荧光分析法 （2）分类 1．原子荧光分析法 2．分子荧光分析法 优点：测定灵敏度高、选择性好 如紫外-可见分光光度法 10-7g/ml, 荧光分析法 10-10～10-12g/ml
第一节 基本原理 一．分子荧光过程
荧光能量＜激发能量，荧光波长＞激发波长
二．分子结构与荧光关系 （一）荧光寿命、荧光效率 1．荧光寿命τf ：除去激发光源，分子荧光强度是激发荧光 强度1/e所需时间
2.荧光效率 jf 如无其他去活化过程，荧光效率 jf =1，事实上jf ≠1。 如荧光素钠在水中jf = 0.92, 荧光素在水中jf = 0.65。
（二）分子结构与荧光的关系 发射荧光的两个条件： 1．强的紫外-可见光吸收 2．一定的荧光效率
1.长共轭结构 共轭程度越高，荧光效率越大，荧光波长长移 除芳香烃外，长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，如维生素A
2．分子的刚性和共平面性 同样的长共轭分子，刚性和共平面性越大，jf ↑，荧光波长 长移
原来共平面性好，分子中加入较大基团后，由于位阻原因， 共平面性↓，荧光减弱
3．取代基 分子上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响，取代基 分为三类： （1）增加分子的π电子共轭程度，荧光效率↑，荧光波 长长移，如-NH2, -OH, -OCH3, -NHR, -NR2, -CN。 （2）减弱π电子共轭程度，荧光↓。如-COOH, -NO2, - C=O, -NO, -SH, -NHCOCH3 --------。 （3）对π电子共轭体系作用较小，如-R, -SO3H, -NH3+。
三. 影响荧光强度的外部因素 1．温度 温度↑，运动速度↑，分子间碰撞几率增加，无 辐射跃迁↑，荧光强度，荧光效率↓。 2．溶剂 一般情况下，溶剂极性↑，荧光强度↑，荧光波 长长移。
3．pH值影响 荧光分子是弱酸、弱碱时，弱酸、弱碱和离 子结构不同，不同酸度中分子和离子间的平衡改变，荧光 强度有差异。 -NH2提高荧光强度，苯胺分子有荧光，pH＜2或pH＞13 溶液中，离子形式存在，不能发射荧光。
4．荧光熄灭剂 当在荧光物质分子溶液中，加入卤素离子、 重金属离子、氧分子及硝基化合物，荧光强度减弱。 5．散射光干扰 （1）瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能 量交换，仅是光子运动方向发生改变，对荧光强度有一定的 干扰。 （2）拉曼光：光子与物质分子发生非弹性碰撞，光子把 能量传给物质分子或从物质分子获得能量，发射出比入射光 波长稍长或稍短的光，对荧光强度干扰很大。
第三节 定量定性分析方法 一．荧光强度与物质浓度的关系 荧光强度正比于荧光物质吸收的 光强度，F∝(Io – I) F = K’(Io – I) I = Io×10-ECL K’为常数，取决于荧光效率， Io----入射光强度，I----透射光强 度，C----溶液浓度，L----液层厚 度, E----物质吸光系数
当浓度C很小，ECL也很小，ECL≤0.05, 上式中第二项 后可以忽略，F = 2.3K’IoECL = KC，在低浓度时，荧光 强度与溶液中荧光物质浓度呈线性关系。 ECL＞0.05，荧光强度与溶液中荧光物质浓度不呈线性 关系。
二．定量分析方法 1．标准曲线法 已知量的标准物质和试 样相同的处理之后，配制一系列标准溶 液，测定这些溶液的荧光强度，以荧光 强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标， 绘制标准曲线，相同条件下测试样荧光 强度，由标准曲线求出荧光物质含量。
2．比例法 标准曲线过原点，在其线性范围内，可由比例 法测定 取已知量的对照品，配制成标准溶液 （Cs），测荧光强度（Fs），相同条 件下，测试样荧光强度（ Fx），按比 例关系计算试样中荧光物质含量Cx。 Fo为空白溶液的荧光强度
3．多组分混合物荧光分析 混合物各组分荧光峰相距较远， 相互之间无显著干扰，分别在各 波长处测各组分荧光强度，直接 求出组分浓度。 荧光峰相互重叠，利用荧光强度 的加和性，求各波长处荧光强度， 结合被测物各自适宜波长处荧光 强度，联立方程求各自的含量。