有效利用木糖产琥珀酸大肠杆菌菌株的构建 10硕： 赵美娜 导师： 赵学明教授

主要内容 选题依据及研究意义 技术路线及依据 实验进程安排 参考文献

选题依据及研究意义 1. 选题背景 ①琥珀酸 与化学合成法相比，生物法合成琥珀酸具有成本低廉，可再生，环保等优点。 制药行业 洗涤剂 suc 制药行业 洗涤剂 离子螯合剂 食品工业 1. 选题背景 ①琥珀酸 与化学合成法相比，生物法合成琥珀酸具有成本低廉，可再生，环保等优点。

suc ②底物：木糖 木质纤维素的单糖组分主要是葡萄糖和木糖（位居第二），阿拉伯糖。 本实验室中有相关的利用木质纤维素产琥珀酸的研究。本课题可以着重从木糖为底物进行研究 suc

2. 本课题研究目的 E.coli本身可以利用木糖生产琥珀酸，但是产生的琥珀酸产率并不理想。 因此，本课题的研究目的在于提高琥珀酸的产率。 AFP111（ΔptsG,ΔpflB,ΔldhA）[1] 因此，本课题的研究目的在于提高琥珀酸的产率。 实际收率 理论收率 Xyl 0.5g/g 1.12g/g Glu 0.83g/g

技术路线 1 2 3 利用基元模式分析（ems）进行敲除路线的模拟分析 GluSuc与XylSuc的共同路线部分（敲除和过表达） 干实验 利用基元模式分析（ems）进行敲除路线的模拟分析 2 湿实验 GluSuc与XylSuc的共同路线部分（敲除和过表达） 3 发酵验证

1. 利用基元模式分析（EMA）进行敲除路线的模拟分析 EMA（基元模式分析）：基元模式分析是一种代谢途径分析（MPA）的工具，用于决策一个代谢网络的结构[2]。 基于化学计量学矩阵，从代谢网络的拓扑结构入手，分析时不需要反应的动力学信息和实验测量数据，得到的结果是能够反映拟稳态条件下细胞的所有途径信息。 EMA一般用于非基因组尺度的代谢模型分析

EMA原理：MPA 根据对于底物和产物的规定，可以减少Ems的数量

所有途径 增加限制 减少Ems 过表达 增加所需要途径的通量

选择模拟敲除的三个标准 敲除后仍能够维持细胞最大的产物得率 敲除后仍能够保持细胞合适的菌体生长速率 敲除后能大幅降低所剩EMS的数目 １ ２ ３ 敲除后能大幅降低所剩EMS的数目

Example[3]

大肠杆菌代谢网路图

戊糖的利用 1004 12 整个代谢网络的Ems：15185 野生菌，厌氧条件下，总EMs： 敲除7个反应后，厌氧条件下，总Ems： 产乙醇并合成生物质的Ems：4（2）0.45g/g

己糖的利用 厌氧时，总的Ems：5010 在敲除了zwf和ndh后： 产生物质的Ems和产乙醇的Ems，在戊糖和己糖的Ems的数量变得相同了 敲除7个反应后，乙醇的收率范围：0.36-0.51g/g

戊糖和己糖共利用 18 总的Ems：92593 敲除7个反应后，Ems： 敲除7个反应后乙醇的收率范围：0.36-0.51g/g 能利用glu或xyl的Ems：12 能利用glu和xyl的Ems：6

xylose glucose

敲除7个反应后的每个Ems的分析 剩余的6个Ems都显示出较高的乙醇收率 Glu：乙醇收率0.36-0.51g/g Xyl：乙醇收率 0.45-0.51g/g

2. GluSuc与XylSuc的共同路线部分（敲除和过表达）[4,5,6,7] Ingram课题组利用代谢进化和代谢工程相结合构建了厌氧条件下，以葡萄糖为底物生产琥珀酸的菌株，其中KJ060 （ΔldhA, ΔpflB, ΔadhE, Δack, ΔmgsA ）菌株可以达到1.61molSuc/molGlu。[2]

PEPSUC 利用pepck的过表达 是否固定CO2 是否产生ATP PEP/SUC 是否消耗NADH ppc 是 否 1 pyk 2

ptsG的敲除 ①在Glu运输过程中，如通过ptsG会消耗1个PEP ②敲除ptsG会减少葡萄糖效应

ΔpflB的影响？ ①pflB催化生成acetyl-CoA，这一反应是合成acetyl-CoA的主要反应，而acetyl-CoA是生物合成的必须代谢物。 ②在敲除了acetyl-CoA后，可以过表达丙酮酸脱氢酶复合体（aceEF, lpd），从而达到产生acetyl-CoA的目的。

共同敲除aspC和sfcA可以增加suc产率，但原因不明。 减少乙酸生成量 ①tdcD编码的酶有丙酸裂解酶，乙酸裂解酶活性； ②tdcE能编码α-酮戊丁酸-甲酸裂解酶，α-酮戊二酸-甲酸裂解酶。 因此，敲除tdcD和tdcE可以减少乙酸的生成，进一步增加琥珀酸的产率。 共同敲除aspC和sfcA可以增加suc产率，但原因不明。

参考文献得出的敲除路线 如果在敲除过程中敲除了pflB后引起了菌体的生长停滞，可以对一下两个基因进行过表达： aceEF,lpd 敲除基因 1 ldhA pflB adhE ackA-pta 2 mgsA 3 ptsG 同时过表达pck 4 poxB 5 如果在敲除过程中敲除了pflB后引起了菌体的生长停滞，可以对一下两个基因进行过表达： aceEF,lpd 然后将上面基因工程菌种中琥珀酸产量高的菌株进行进一步的基因敲除及过表达： tdcD,tdcE的共敲除，可以减少乙酸的生产 aspC,sfcA的共敲除，可以增加琥珀酸的产量

实验进程安排 第一阶段：文献搜集整理 第二阶段：通过文献和EMA进行模拟得出敲 除路线 第三阶段：分子实验（基因敲除与过表达） 第四阶段：模拟验证，并计算理论得率 第五阶段：发酵实验

参考文献 [１] Andersson, C., D. Hodge, et al. (2007). "Effect of different carbon sources on the production of succinic acid using metabolically engineered Escherichia coli." Biotechnology Progress 23(2): 381-388. [２] Trinh, C. T., A. Wlaschin, et al. (2009). Elementary mode analysis: a useful metabolic pathway analysis tool for characterizing cellular metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology 81(5): 813-826. [３] Trinh, C. T., P. Unrean, et al. (2008). Minimal Escherichia coli cell for the most efficient production of ethanol from hexoses and pentoses. Applied and Environmental Microbiology 74(12): 3634-3643. [４] Jantama, K., M. J. Haupt, et al. (2008). Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that [５] Zhang, X. L., K. Jantama, et al. (2009). Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(48): 20180-20185. [６] Zhang, X., K. Jantama, et al. (2009). Reengineering Escherichia coli for Succinate Production in Mineral Salts Medium. Applied and Environmental Microbiology 75(24): 7807-7813. [７] Jantama, K., X. Zhang, et al. (2008). Eliminating Side Products and Increasing Succinate Yields in Engineered Strains of Escherichia coli C. Biotechnology and Bioengineering 101(5): 881-893.

欢迎大家批评指正