Enzyme 第9章 酶促反应动力学

一、化学动力学基础 化学反应的两个基本问题： 反应进行的方向、可能性和限度 反应进行的速率和反应机制 化学热力学 化学动力学

（一）反应速率及其测定 ——以单位时间内反应物或生成物 浓度的改变来表示。

（二）反应分子数和反应级数 1.反应分子数： ——反应中真正相互作用的分子的数目 单分子反应：A P 双分子反应：A+B P+Q

单分子反应 v = kc 双分子反应 v = kc1c2 c 、c1、c2 ：反应物浓度（mol/l） k：比例常数/反应速率常数

2.反应级数 能以v = kc表示，为一级反应； 能以v = kc1c2表示，则为二级反应； v 与反应物浓度无关，则为零级反应。 双分子反应、一级反应

（三）各级反应的特征 1.一级反应： 反应速率与反应物浓度的一次方成正比。 v = kc

半衰期t1/2：有一半反应物转化为产物所需的时间 C0 产物的增加 [P] C0/2 反应物的消耗 C t½ t 半衰期t1/2：有一半反应物转化为产物所需的时间 lnC0 k lnC0/2 C t½ t 当t=t½时，c=1/2c0,则t½＝0.693／k,即半衰期与反应物的初浓度无关。

2.二级反应： v = k（a- x）（b – x） a 、b：反应物A、B的初浓度 x：t时已发生反应的物质浓度 （a- x）、（b – x）： t时后A、B的浓度

3.零级反应： v = k 一级反应：半衰期与反应物的初浓度无关 二级反应：半衰期与反应物的初浓度成反比 零级反应：半衰期与反应物的初浓度成正比

二、底物浓度对酶反应速率的影响 单底物、单产物反应； 酶促反应速度一般在规定的反应条件下， 用单位时间内底物的消耗量和产物的生 成量来表示； 研究前提 单底物、单产物反应； 酶促反应速度一般在规定的反应条件下， 用单位时间内底物的消耗量和产物的生 成量来表示； 反应速度取其初速度，即底物的消耗量 很小（一般在5﹪以内）时的反应速度； 底物浓度远远大于酶浓度。（[S] 》[E]）

初速度 酶促反应速度逐渐降低 产 物 0 时 间 酶促反应的时间进展曲线

在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。 反应初速度随底物浓度变化曲线

[S] V Vmax 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。

[S] V Vmax 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。

[S] V Vmax 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应

（一）中间络合物学说 三个假设： E + S ES P + E k1 k2 k3 k4 （1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V＝k3[ES]。 （2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。 （3）P→0 忽略 这步反应

（二）酶促反应的动力学方程式 1、米氏方程的推导

1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)。 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── [S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)

稳态时ES浓度不变 反应速度 (Ⅲ) V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度 (Ⅰ) k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES] E + S ES P + E k1 k2 k3 稳态时ES浓度不变 反应速度 V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度 k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES] E的质量平衡方程 [E]=[Et] - [ES] (Ⅲ) (Ⅰ) (Ⅱ)

稳态时ES浓度不变 反应速度 V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度 k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES] E的质量平衡方程 E + S ES P + E k1 k2 k3 稳态时ES浓度不变 反应速度 V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度 k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES] E的质量平衡方程 [E]=[Et] - [ES] 米氏方程 V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et] V= V[S] Km + [S] Km= k2 + k3 k1 米氏常数

a.当[S]很小时 V=V[S]/Km 一级反应 V[S] Km + [S] V= b.当[S]很大时 V=V[S]/[S]=V 0 级反应 反应初速度随底物浓度变化曲线 V= V[S] Km + [S] b.当[S]很大时 V=V[S]/[S]=V 0 级反应 米氏曲线 混合级 a.当[S]很小时 V=V[S]/Km 一级反应

Km=? Km = [S] 1 V 2 ＝ V [S] Km + [S] Km + [S] = 2[S] 若 V＝V/2 V[S]

2、动力学参数的意义 （1）米氏常数Km的意义 Vmax[S] Vmax ＝ 2 Km + [S] Km＝[S] V Vmax Vmax/2 ∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。

与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。 ①Km是酶的特性常数： 与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。 酶 底物 Km(mmol/L) 脲酶 尿素 25 溶菌酶 6-N-乙酰葡萄糖胺 0.006 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 6-磷酸-葡萄糖 0.058 胰凝乳蛋白酶 苯甲酰酪氨酰胺 2.5 甲酰酪氨酰胺 12.0 乙酰酪氨酰胺 32.0

②可以判断酶的专一性和天然底物 Km值最小的底物——最适底物/天然底物 1/Km近似表示酶对底物的亲和力： 1/Km越大、亲和力越大

Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力） Km越小，亲和力越强。 [S]很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要 E + S ES P + E k1 k2 k3 Km越小，亲和力越强。 [S]很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要

③根据Km： 判断某[s]时v与Vmax的关系 判断抑制剂的类型 ④ Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径

一底物多酶反应 丙酮酸 丙酮酸浓度较低时： 代谢哪条途径决定于Km最小的酶 乳酸脱氢酶（1.7×10-5） 乳酸 丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3） 丙酮酸 乙醛 丙酮酸脱氢酶 （1.3×10-3） 乙酰CoA 丙酮酸浓度较低时： 代谢哪条途径决定于Km最小的酶

（2）Vmax和k3（kcat)的意义 一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。 [S]很大时， Vmax＝ k3[E] 。

（3） kcat/km的意义： V= Vmax[S] Km + [S] ∵Vmax=kcat[Et] ∴ V= kcat[Et][S] 当[S] <<Km时，[E]＝[Et]

kcat/km＝ 是E和S反应形成产物的表观二级速率常数。 其大小可用于比较酶的催化效率。 kcat/km的上限为k1,即生成ES的速率，即酶的催化效率不超过E和S形成ES的结合速率 kcat/km的大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。

3、 Km与V的求取 （1）Lineweaver-Burk双倒数作图法

蔗糖酶米氏常数（Km）的测定 1. 配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保温； 2. 加入3U/ml已在35 ℃水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应； 3. 各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值； 4. 作图

（2）Eadie-Hofstee作图法

v Vmax 斜率－Km V [S]

（3）Hanes-Woolf作图法

斜率= 1/Vm Km/Vm -Km [S]/V [S]

（4）Eisenthal和Cornish-Bowden线性作图法 v Vmax [S] －3Km－2Km－Km

（三）多底物的酶促反应动力学 1.酶促反应按底物分子数分类： 分为单底物、双底物和三底物反应

2.多底物反应按动力学机制分类： （1）序列反应或单－置换反应 ①有序反应（ordered reactions） A和Q竞争地与自由酶结合 领先底物 释放 释放 A和Q竞争地与自由酶结合

②随机反应（random reactions） 如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应

(2)乒乓反应或双－置换反应 A AE PE’ P E E’ Q EQ EB B A和Q竞争自由酶E形式 B和P竞争修饰酶形式E’

3.双底物反应的动力学方程 （1）序列机制的底物动力学方程及动力学图 —— 在B的浓度达到饱和时A的米氏常数 —— 在A的浓度达到饱和时B的米氏常数 —— 底物A与酶结合的解离常数 —— 底物A、B都达到饱和时最大反应速率

（2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图 —— 在B的浓度达到饱和时A的米氏常数 —— 在A的浓度达到饱和时B的米氏常数

三、酶的抑制作用 失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。 抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。 抑制剂：能引起抑制作用的物质。

（一）抑制程度的表示方法 以反应速率的变化表示 V0 ： 不加入抑制剂时的反应速率 加入抑制剂后的反应速率 Vi ：

1.相对活力分数（残余活力分数） Vi V0 2.相对活力百分数（残余活力百分数） Vi V0

3.抑制分数 ——指被抑制而失去活力的分数 抑 制 率 Vi V0 4.抑制百分数 Vi V0

（二）抑制作用的分类 不可逆抑制与可逆抑制 依据： 能否用透析、超滤等物理方法 除去抑制剂，使酶复活。

不可逆抑制 1、不可逆抑制作用 ： 抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连 很多为剧毒物质 重金属、有机磷、有机汞、有机砷、 氰化物、青霉素、毒鼠强等。 不可逆抑制

不可逆抑制 2、不可逆抑制剂 非专一性不可逆抑制剂 （作用于一/几类基团） 不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂 （作用于某一种酶的 活性部位基团）

（1） 非专一性不可逆抑制剂 ①重金属离子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高浓度时可使酶蛋白变性失活； 低浓度时对酶活性产生抑制。 ——通过加入EDTA解除

②烷化剂（多为卤素化合物） H2N-CH-COOH  CH2 碘乙酸 SH + ICH2COOH H2N-CH-COOH  CH2 HI   H2N-CH-COOH  CH2 SH 碘乙酸 + ICH2COOH H2N-CH-COOH  CH2 S-CH2COOH HI +

③有机磷化合物（敌百虫、沙林）

P OC2H5 S 有机磷农药部分 胆碱酯酶OH

胆碱乙酰化酶 胆碱酯酶 胆碱 乙酰胆碱 积累导致神经中毒症状

如何紧急救治？ 排毒 洗胃、喝鸡蛋清牛奶 导泄、利尿 血液透析（清除游离状态毒物） 解毒药：解磷定

RO O RO O RO X RO O—E P + E—OH P + HX 有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶(失活) 酸 有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶(失活) 酸 解毒 -- -- -- 解磷定(PAM)： RO O RO O—E P + -CHNOH 磷酰化酶(失活) N + CH3 -CHN O OR O OR +E—OH P 解磷定

④有机汞、有机砷化合物 ——与酶分子中-SH作用； 可通过加入过量巯基化合物解除。

⑤氰化物、硫化物和CO ——与酶中金属离子形成稳定的络合物 如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合 ⑥青霉素（penicillin） 与细菌糖肽转肽酶Ser-OH活性， 影响细胞壁合成。

（2） 专一性不可逆抑制剂 ①Ks型 具有底物类似的结构——（设计） 带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制） ∵利用对酶亲合性进行修饰 ∴亲合标记试剂（affinity labeling reagent）

②Kcat型 具有底物类似的结构 本身是酶的底物 还有一潜伏的反应基团 “自杀性底物”

3、可逆抑制作用： 可逆抑制 抑制作用可通过透析等方法除去。 竞争性抑制(competitive inhibition) 原因：非共价键结合 可逆抑制 竞争性抑制(competitive inhibition) 非竞争性抑制(non-competitive I.） 反竞争性抑制(uncompetitive I.)

（1）竞争性（Competitive)抑制

I： 抑制剂（ inhibitor）

【举例】 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2 延胡索酸 琥珀酸

竞争性抑制

磺胺类药物的抑菌机制： 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸 二氢叶酸 合成酶

利用竞争性抑制是药物设计主要思路 磺胺类药抗菌机理： （与对氨基苯甲酸是结构类似物） 竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖 人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。

生物碱麻醉—竞争性替代 生物碱—吗啡、海洛因、可卡因、尼古丁 吗啡 海洛因

麻醉机理 痛觉神经信号 脑肽(E)控制痛觉信号的释放 生物碱竞争性替代脑肽—麻醉致幻 阿片—鸦片类物质 源自—37C医学网

（2）非竞性（Non-competitive)抑制 无法形成产物 抑制物

Noncompetitive inhibition

（3）反竞争性（Uncompetitive ）抑制

(三)可逆和不可逆抑制作用的鉴别 1：反应体系不加I 2： 体系中加入 一定量不可逆抑制剂 3：体系中加入 一定量可逆抑制剂 v [E] 2

[E] v 不可逆抑制剂 的作用 [E] v 可逆抑制剂 的作用 [I ]→ [I ]

(四）可逆抑制作用动力学

1.竞争性抑制

消去[ES]

斜率 斜率

竞争性：I与S与酶活性中心结合机会均等 V下降发生抑制 Km增大亲和力 Vmax不变 [S] 增大， I结合机率减小

Km 变大，Vmax不变

2.非竞争性抑制

截距

V下降发生抑制 Km不变 亲和力不受影响 Vmax减小 部分酶始终失活

Km不变，Vmax变小

3. 反竞争性抑制作用

Km、Vmax都变小

四、温度对酶反应的影响 上图反映出温度如何影响酶活力？ 最适温度 动物酶 35~40℃ 植物酶 40~50℃ 微生物 大部分 40~50℃ 产物累积量 相对酶活％ 最适温度 动物酶 35~40℃ 植物酶 40~50℃ 微生物 大部分 40~50℃ 个别高温菌 90℃以上 上图反映出温度如何影响酶活力？ 最适温度

温度越高，活化分子越多，反应速度快； 酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。

五、pH 对酶反应的影响 最适pH时的酶活力最大 最适pH因酶而异，多数酶在7.0左右 是酶的特性之一

六、激活剂对酶反应的影响

①无机离子 阳离子 K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+等 阴离子 Cl -、Br -等

②中等大小的有机分子 ③某些激酶