专题2 微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1.分离微生物的原理 2.利用选择培养基分离细菌 3.统计细菌数目的方法

尿素的发现历史 1773年，伊莱尔·罗埃尔（Hilaire Rouelle）发现尿素。1828年，德国化学家弗里德里希·维勒首次使用无机物质氰酸铵（NH4CNO，一种无机化合物，可由氯化铵和氰酸银反应制得)与硫酸铵人工合成了尿素。本来他打算合成氰酸铵，却得到了尿素。尿素的合成揭开了人工合成有机物的序幕，实际上开辟了有机化学。

一、课题背景 1、尿素的利用 2、细菌利用尿素的原因 CO(NH2) 脲酶 + CO2 NH3 + H2O 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2) 脲酶 + CO2 NH3 + H2O

3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 1.怎样才能从土壤中分离出分解尿素的细菌呢？

二、研究思路 启示： （一）筛选菌株 a.提出的问题 —如何寻找耐高温的酶？ b.解决问题的思路 —寻找耐高温环境； c.原理 美国黄石国家公园的一个热泉 水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌 （一）筛选菌株 a.提出的问题 —如何寻找耐高温的酶？ b.解决问题的思路 —寻找耐高温环境； c.原理 —高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。 启示： 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

（二）实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 :要分离某种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等方法： ⑴抑制大多数微生物不能生长， ⑵造成有利于该菌生长的环境。 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 之后讲课本P22的最上面内容

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 概念：选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基:分离自生固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞

（三）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需 培养基 KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 （1）该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ （2）此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁殖，而受到抑制，所以用此培养基能够选择出分解尿素的微生物。

（四）统计菌落数目 1、显微镜直接计数： （1）方法：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 （2）缺点 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；

（四）统计菌落数目 1、显微镜直接计数： 2、活菌计数法（间接计数法) 稀释涂布平板→统计菌落数 （2）原理： 1个菌落→1个活菌 （1）操作方法： 稀释涂布平板→统计菌落数 （2）原理： 1个菌落→1个活菌 （3）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M 其中C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。 当样品的稀释度足够高时，固体培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？ 如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值

（四）统计菌落数目 2、活体计数法（间接计数法) ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上 的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中 的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

（四）统计菌落数目 显微镜直接计数 活菌计数法 比浊法 膜过滤法 计数法

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数过程 土壤取样　从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入无菌信封密封 ↓ 制备培养基　准备选择培养基，以尿素为唯一氮源制备9个平板培养基

样品的稀释　在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角烧瓶中，振摇使土样与水充分混合，将菌分散。制成101倍土壤稀释液，用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水试管中，吹吸三次，使充分混匀，制成102倍土壤稀释液，以此类推制成103、104、105、106倍土壤稀释液 ↓

培养观察　将培养基平板倒置于30～37℃温室中培养1～2天，每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 ↓ 菌落计数　常用稀释涂布平板法，设计如下表格记录并计数

稀释度 104 105 106 1 2 3 平均 值 菌落数 /平板 菌数/ 克土壤

通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 在做本课题实验时，利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，只是自己所用的土壤样品不同，但此时也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说服力的证据。 分析：一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质)。 究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。 一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

（五）设置 对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。

土壤中分解尿素的分离与计数(1) 研究思路 菌种筛选 统计菌落菌数目 设置对照

D C D 1.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素 1.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素 2.使用选择培养基的目的是（ 　） A.培养细菌　　 B.培养真菌　　 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 C D 3.统计菌落数目的方法有 （ ） ①涂布平板法 ②重量法 ③直接计数法 ④比浊法 ⑤ 生理指标法 ⑥ 膜过滤法 A.①②③⑥ B.③④⑤⑥ C.②③④⑥ D.①③④⑥

C C 4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐 4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　　） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐 C 5．通过配置特殊的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。下列哪项操作最终不能达到分离出相应微生物的目的(　　) A．在无氮培养基上可从多种细菌中分离出圆褐固氮菌 B．在缺乏有机碳源的培养基上可以从多种细菌中分离得到硝化细菌 C．在培养基中加青霉素可从混杂的真菌中分离到酵母菌 D．在培养基中加高浓度食盐可分离得到金黄色葡萄球菌 C