第八章 发酵工程 FERMENTATION ENGINEERING 8.1 发酵工程概况 8.2 微生物发酵过程 8.3 发酵操作方式 我们知道了生物体的代谢是指生物细胞内所发生的全部的化学反应。在生物体的代谢过程中，会产生多种多样的代谢产物，如氨基酸、维生素、抗生素等。而且，这些代谢产物又是我们人类所需要的。那我们能不能通过对微生物的培养来大量生产各种代谢产物呢？这就是我们今天所要讨论的“发酵工程”。 微生物工业的经济效益很高。用大肠杆菌生产生长激素释放因子，从9升细菌培养液所得的激素数量等于大约从50万头羊脑中提取得到的数量。需要从1万头牛的胰脏才能提取1公斤结晶蛋白酶，而通过微生物发酵，只需几百公斤淀粉、麸皮、黄豆粉等，几天时间就可生产出这些数量的酶。 8.4 下游加工过程

8.1 发酵工程概况 发酵（fermentation)一词最初来自拉丁语“fervere”，是指酵母作用于果汁或发芽谷物时产生CO2的现象。 发酵工程：利用微生物(包括重组微生物)以及动植物细胞在适当条件下的大规模培养来生产商业产品。 发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，又称为微生物工程。 发酵对不同的对象而言具有不同的意义：对生化学家而言，它指的是有机化合物进行分解代谢释放能量的过程，但对工业微生物学家而言，其意义要更为广泛。

（1）自然发酵阶段 8.1.1发展简史 在西方有啤酒、葡萄酒、面包、干酪；在东方有酱油、清酒、醋等等。 人们不知道微生物与发酵的关系，很难人为控制发酵过程，生产只能凭经验，口传心授。 发酵是一门古老的技术，古代人在还不知道发酵是什么的时候，就已经利用它来制造一些有用的食品。这些产品都是几千年来，人们凭着智慧和经验，在没有亲眼见到微生物的情况下，巧妙利用微生物所获得的产品。

（2）纯培养技术的建立 法国：巴斯德，发酵原理; 荷兰，A.V.Leeuwenhoek： 1632-1732,首先观察到微生物 L. Pasteur 长久以来，人们只是简单地将生物界划分为动物和植物两大类，直到显微镜的发明，人们才观察到微生物的存在。这是列文虎克的功劳。 而法国生物学家巴斯德研究了酒精发酵的生理意义，证实发酵是微生物活动的结果，不同种类的微生物发酵可引起不同的发酵过程。巴斯德的研究给发酵技术带来巨大的影响，随着人们对发酵认识的深入以及基因工程、细胞融合等现代化生物技术的逐渐成熟，发酵这门古老的技术也焕发了新的青春。 法国：巴斯德，发酵原理; 德国：科赫等，首先发明了固体培养基，得到细菌的纯培养物，由此建立了单种微生物的分离和纯种培养技术。 Koch, Robert (1843-1910)

科赫的世界第一 发明了细菌照相法； 发现了炭疽热的病原细菌——炭疽杆菌，并提出著名的病原物诊断的科赫法则； 证明了一种特定的微生物引起一种特定疾病的原因； 分离出伤寒杆菌； 发明了蒸汽杀菌法； 分离出结核病细菌； 发明了预防炭疽病的接种方法； 发现了霍乱弧菌； 提出了霍乱预防法； 发现了鼠蚤传播鼠疫的秘密； 1.建立了研究微生物的一系列重要方法，尤其是在分离微生物纯种的方面，还创立了许多显微技术，包括细菌鞭毛染色在内的许多染色方法、悬滴培养法以及显微摄影技术。 Robert Koch（1843—1910）

科赫法则(1884) 1.病原微生物总在患传染病的动物发现，而不存在健康的个体中； 2.这一微生物可以离开动物体并被培养为纯种培养物； 3.这种纯种培养物接种到敏感的动物后，应当出现特有的病症； 4.该微生物可以从患病的实验动物中重新分离出来，并可在实验中再次培养，此后它仍然应该同原始病原菌微生物相同。 德国细菌学家科赫于1884年提出了该法则。

（3）深层通风培养技术 （30-50年代） 1929年，英国A. Fleming发现青霉素，40年代得到进一步研究和开发，开拓了抗生素发酵工业，建立了以通气搅拌技术为基础的深层培养法 现代发酵工程发端于20世纪40年代的抗生素工业，它为现代发酵工程的发展奠定了基础 人为控制发酵过程的时期 1928年，英国细菌学家弗莱明爵士发现能够抑制葡萄球菌的点青霉，其产物被称为青霉素。当时其成果无人注意。 40年代初，二战中对抗细菌感染药物的极大需求，促使人们从新研究了青霉素。在1945年青霉素投入大规模生产。它采用了深层培养技术，即机械搅拌通气技术，从而推动了抗生素工业乃至整个发酵工业的快速发展。抗生素工业的发展又促进了其他发酵产品的出现，如50年代的氨基酸工业，60年代的酶制剂等。 这个时期的产品有酵母、酒精、丙酮、丁醇、有机酸等，主要是一些厌氧发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。 这开创了人为控制发酵过程的时期，再加上简单密封式发酵罐的发明，发酵管理技术的改进，发酵工业逐渐进入了近代化学工业的行列。

（4）代谢控制发酵技术 （1956-1970） 1956年日本木下祝郎发明谷氨酸发酵技术，开始了代谢控制发酵技术。 60年代，许多国家开发了微生物菌体作为饲料蛋白（单细胞蛋白），使发酵工业取得了许多进展。 开拓发酵原料时期 开拓发酵原料时期。 谷氨酸是鲜味剂味精的主要成分，以前用植物(如大豆)蛋白质水解法生产。1957年，日本率先用微生物发酵法生产成功。常用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等。培养基通常用豆饼(或马铃薯等)的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等配制而成，呈液体状态，因此也称培养液。其中的生物素是生长因子。培养液配制完成以后，投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌，冷却后，在无菌条件下加入菌种，即为接种。 谷氨酸棒状杆菌是好氧菌，因此，发酵过程要不断地通入无菌空气，并通过搅拌，使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中(称溶氧)；同时，也能使菌种与培养液充分接触，提高它们对原料的利用率。在温度为30～37℃、pH为7～8.0的条件下，经28～32h，培养液中就会生成大量的谷氨酸。最后，将谷氨酸从培养液中分离提取出来，通常每升培养液中能得到谷氨酸50～100g。提取出来的谷氨酸用适量的Na2CO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤，便制成了味精。

（5）与基因工程的结合 （1970-至今） 基因重组，创造新物种 固定化细胞/固定化酶 动植物组织培养 70年代发展起来的基因工程技术，推动发酵工业向新的方向发展。如它可以构建工程菌，利用工程菌的发酵，产生原来微生物所不能产生的产物（如重组人胰岛素、重组人干扰素、血细胞生成素EPO、各种生长因子等）。

8.1.2发酵产品的类型 1.菌体：酵母、单细胞蛋白、药用真菌、杀虫剂等； 2.酶制剂：淀粉酶、糖化酶、青霉素酰化酶等； 3.微生物代谢产物：初级代谢产物、次级代谢产物； 4.微生物的转化：微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成更有经济价值的产物。 5.生物工程细胞：利用现代生物技术所获得的细胞进行培养的新型发酵 发酵工业，涉及到各式各样的发酵产品的生产。但就产品类型而言，发酵主要有五大类型。

（1）以菌体为产品的发酵 指微型藻类、酵母、非病性细菌、真菌、担子菌等单细胞生物体内所含的蛋白质 酵母、藻类、担子菌类、冬虫夏草、茯苓、杀虫剂等 单细胞蛋白(微生物蛋白、菌体蛋白) 指微型藻类、酵母、非病性细菌、真菌、担子菌等单细胞生物体内所含的蛋白质 微生物菌体发酵是以获得具有多种用途的菌体为目的的发酵，如用于面包工业的酵母发酵和用于人类或动物饲料的微生物菌体蛋白(单细胞蛋白）发酵，用于生物防治的农用微生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌、绿僵菌、白僵菌等。

（2）以微生物的酶为产品 生产菌大多是酵母、细菌和霉菌等。 目前工业应用的酶大多来自微生物发酵 微生物生长繁殖快，周期短，产量高 培养方法简单，原料源广价廉，经济效益高 微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全 微生物有较强的适应性和应变能力，可通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种 微生物酶发酵：随着酶制剂的广泛应用，目前工业用酶大都来自微生物发酵。因为微生物种类多、产酶品种多、生产容易、成本低。所产的酶多用于食品、轻工业及医药行业。如淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖，葡萄糖氧化酶用于检测血液当中葡萄糖的含量，青霉素酰化酶用于生产半合成青霉素所用的中间体6-氨基青霉烷酸等。

（3）以微生物的代谢产物为产品 初级/中间代谢产物：微生物生长的对数生长期，产生菌很多 次级代谢产物 微生物生长的稳定期 产生菌主要为：丝状放线菌（链霉菌）、丝状真菌和产孢子的细菌 酶抑制剂、抗生素、生长促进剂 代谢发酵：初级代谢产物的产生菌非常广泛，而次级代谢产物的产生菌则仅仅有少数几个类群，一般是丝状放线菌、丝状真菌和产孢子的细菌。其中放线菌特别是链霉菌产生的次级代谢产物最多。

初级代谢产物和次级代谢产物 在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。 在菌体生长稳定期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等，这些产物与菌体的生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。 微生物在生长繁殖过程中有一定的发育过程，即适应期、对数生长期、静止期和死亡期。 在对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类、糖类等，使菌体生长繁殖所必需的。这些产物叫做初级代谢产物。许多代谢产物在经济上具有相当的重要性，因而形成了各种不同的发酵工业。如微生物酶、有机酸、维生素、多糖、氨基酸和核酸等的发酵。 在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些在生长期中不能合成的具有一些特性的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。（在菌体低生长速率的连续培养中也会出现次级代谢，因此可认为次级代谢产物的形成是菌体缓慢生长或停止生长的情况下的一种特征。） 次级代谢是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物的积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。 初级代谢产物的中间体或产物往往是次级代谢的前体或起始物。 次级代谢产物多为低分子量化合物，但其化学结构类型多样。 在次级代谢产物中最重要的是抗生素，它们是最大的一类发酵产品，在医疗及其他方面占有重要的地位。抗生素不仅能抗菌，还有抗病毒、抗癌和其他生理活性，因而已成为发酵工业的重要支柱。 次级代谢和初级代谢一样要受到许多调节机制的控制。要提高产生菌的次级代谢产物的产量，就要设法解除其控制，提高合成基因的量。了解次级代谢产物的生物合成途径，知晓哪些步骤是限速反应。

（4）生物转化发酵 利用微生物细胞的一种或多种酶，作用于一些化合物的特定部位(基团)，使它转变成结构相似但具有更大经济价值的化合物的生化反应过程 最古老的生物转化就是利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。 微生物转化发酵：就是利用微生物细胞的一种或多种酶把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物的生化反应。可进行的转化反应包括脱氢、氧化、脱水、缩合、脱羧、氨化、脱氨和异构化反应等。但是多数微生物转化反应的转化率较低,能够达到工业化和商品化的还不多。

（5）生物工程细胞的发酵 指将基因工程菌或细胞融合的杂交细胞以及动植物细胞或固定化细胞等进行培养的新型发酵。 细胞融合→杂交细胞 DNA重组→基因工程菌 细胞培养→动植物细胞或固定化活细胞

8.1.3发酵技术的特点 1.多个反应过程可在发酵过程中一次完成； 2.反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备很简单； 3.原料来源广泛，可再生； 4.可特异性地进行复杂的化学反应； 5.要求无菌操作。

8.1.4发酵工程的应用 1.医药工业：抗生素、维生素、胰岛素、乙肝疫苗、干扰素等； 2.食品工业：微生物蛋白、氨基酸、饮料、酒类和一些食品添加剂（柠檬酸、乳酸、天然色素等）； 3.能源工业：酒精、沼气、微生物采油； 4.化学工业：化工原料（乙醇、丙酮、丁醇）、生物表面活性剂； 5.农牧业：生物固氮、生物杀虫剂、微生物饲料； 6.冶金工业和环境保护。 发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分，得到越来越广泛的应用。 发酵工程从20世纪40年代初逐渐兴起，50年代开始将代谢控制发酵技术和诱变育种技术应用于发酵工程。70年代，由于基因工程、细胞工程等生物工程技术的利用，使发酵工程进入了定向育种的新阶段，80年代以后由于以计算机技术为代表的高科技手段应用于发酵工程，使发酵工程得以迅猛发展。在医药工业、食品工业、农业、冶金业、环境保护等许多领域得到了广泛的应用，逐渐形成了规模庞大的发酵工业。现在，发达国家发酵工业的总产值已占到国民生产总值的5％左右。 在一些发达国家，其发酵产品中，医药产品的产值占20%。医用抗生素的用量约占临床用药的50%。 抗生素产业在我国的产值占医药品总产值的20%左右。 现代发酵工程是生物工程的重要内容之一，是生物细胞产物通向工业化的必由之路。因此，发酵工业已经发展成为规模庞大的现代化企业。随着生物工程的研究进展，已经筛选出来各种生物活性物质和各种基因工程菌，为发酵工业开辟了新的领域。

8.2 微生物发酵过程

8.2.1 工业生产常用微生物 （1）细菌（大肠杆菌、氨基酸棒杆菌） （2）放线菌（当今临床上使用的抗生素，有三分之二是用放线菌发酵生产的。） （3）酵母菌 （4）霉菌 （5）其他微生物：a 担子菌 b 藻类 灰色链霉菌：产链霉素；金霉素链霉菌：金霉素；氨基酸棒杆菌：产氨基酸 放线菌是一类重要的可再生资源，以产生众多的抗生素而受到重视。

当前发酵工业所用菌种的总趋势 从野生菌转向变异菌； 从自然选育转向代谢控制育种； 从诱发基因突变转向基因工程的定向育种。 用微生物发酵的方法生产产品，首先要有一个良好的菌种。从自然界中分离得到的菌种，生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为发酵工业需要微生物能够积累大量的代谢产物，而在正常的生理条件下，微生物依靠其自身的代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。因此，就需要进行菌种选育和控制培养条件。 菌种选育的目的是改良菌种的特性，使之符合工业生产的要求。

8.2.2 培养基 培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。培养基的成分和配比，对微生物的生长、繁育、代谢及产物的积累，甚至对发酵工业的生产工艺都有很大的影响。

培养基的种类 依据其在生长中的用途，可将培养基分成： （1）孢子培养基，是供制备孢子用的 。 （2）种子培养基，是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。 （3）发酵培养基，是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。 孢子培养基的配制要求：a)营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不利于产孢子；b)无机盐的浓度要适当，否则影响孢子量和孢子颜色；c)合适的pH和湿度。 种子培养基的配制要求：a) 营养比较丰富和完全，氮源和维生素的含量高，但总浓度应略稀薄，以达到较高的溶氧水平；b)在微生物代谢过程中维持稳定的pH。 一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。而无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机氮源和无机氮源。 最后一级的种子培养基的成分最好能较接近于发酵培养基，目的是使种子进入发酵培养后能迅速适应，快速生长。 发酵培养基的配制要求： a)含菌体生长所必需的元素和化合物; b)含有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。

8.2.3 发酵的一般过程 1、菌种制备 2、种子扩大培养（种子制备）：将保存的生产菌种逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。 3、发酵：微生物合成大量产物的过程。 4、下游处理（产品的分离纯化及废物处理） 发酵结束后，对发酵液和生物细胞进行分离及提纯精制，将发酵产物制成合乎要求的产品。 发酵工艺多种多样，但基本上包括以下几个过程：菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等内容。

（1） 菌种的选育 如果生产的是微生物直接合成的产物，如青霉素、谷氨酸等，则可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。 如果生产的是一般微生物不能合成的产品，则可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的。 经自然界分离、筛选获得的有价值的菌种，在用于工业生产之前必须经人工选育以得到具一定生产能力的菌种。发酵工业的决定因素就是优良菌种的获得。 1 菌种的选育：最初，人们是从自然界寻找所需要的菌种的，但用这种方法得到的菌种，产量一般都比较低，不能满足工业上的需要。20世纪40年代，微生物学家开始用人工诱变的方法育种，就是用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，使菌种产生突变，再从中筛选出符合要求的优良菌种，如不能合成高丝氨酸脱氢酶的黄色短杆菌就是用这种方法获得的。这种育种方法已在氨基酸、核苷酸、某些抗生素等的发酵生产中获得成功。例如，在1943年刚开始生产青霉素时，青霉素的产量只有20μg/mL左右，经过长期的诱变育种，如今青霉素的产量已达到85 000μg/mL以上。 从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，经分离、纯化及选育后，才能供给发酵使用。为保持和获得稳定的高产株，还须定期进行菌种的纯化和育种，筛选出高产量和高质量的优良菌株。同时要重视菌种的保存工作，一般采用砂土管或冷冻干燥管保存。 基因工程菌 例如：可将人工合成的人的胰岛素基因与大肠杆菌的质粒结合，形成重组DNA，再把重组DNA导入大肠杆菌细胞内形成工程菌。通过筛选则可培养出能生产人的胰岛素的菌种。

（2）种子扩大培养（种子制备） 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程 一个由实验室制备到车间生产的过程 目的：使菌体在短时间内快速增殖，培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用 工业发酵要想在较短的时间内得到大量的发酵产物，这无疑需要大量的菌体。如何得到发酵生产所需要的大量菌体来缩短生产周期呢？这就需要经过多次的扩大培养。 种子的制备包括两个过程：在固定培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足而不被其他杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。 问题：种子的扩大培养与发酵生产过程中的培养有何不同呢？ Q：种子的扩大培养与发酵生产过程中的培养有何不同呢？ 扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖，而发酵过程中的培养是为了获得代谢产物，目的不同，采用的培养条件就有可能不同。例如：在酒精发酵过程中，扩大培养是为了促使酵母菌快速增殖，因此是在有氧条件下进行。而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下进行以获得大量的酒精。

种子制备工艺 生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养 实验室种子制备阶段：琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养 种子罐的作用： 保藏菌种经无菌方式接入适合于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。产孢子能力强的，及孢子发芽、生长繁殖快的菌种，可用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。如生产青霉素的产黄青霉菌。 产孢子能力不强的，或孢子发芽慢的菌种可用摇瓶液体培养法，获得菌丝体，作为种子。如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那霉菌。 种子罐的作用： 使孢子瓶中有限数量的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌丝体，接入发酵培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。

（3） 发酵 是整个发酵工程的中心环节 是在无菌状态下完成纯种培养的过程，因此，各个环节都需保持无菌，包括：培养基、培养设备、通入的空气和中途的补料、转移的种子等等 发酵工艺的调控是整个发酵工程最核心最重要的部分 将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，是不是发酵生产就能顺利地进行呢？不是的！还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行控制。在发酵罐内部的代谢变化比较复杂，受许多因素所控制。因此要使发酵得到预期的结果，需要各方面密切配合和严格操作。 如果发酵产物是初级代谢产物，则主要在菌体生长的对数生长期产生。 如果发酵产物是次级代谢产物，则主要在菌体生长的稳定期产生。 因此，要在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多的发酵产物。同时，还应对发酵条件进行严格控制，因为发酵生产中温度、pH、溶氧量等对发酵过程有重大影响。 发酵过程中的溶氧量、pH、磷酸盐等都能影响产物的代谢途径，从而影响代谢产物的合成。同时，随着代谢的进行，产热的增加、某营养物质的消耗，以及某些酸性和碱性物质的产生，会使温度、pH等发生变化，这些都会对微生物的生长造成不利影响。因此，需要对发酵过程的中温度、pH、溶氧量等发酵条件进行严格的控制，以保证菌体生长和代谢途径朝着有利人类的方向进行。

（4） 下游处理（分离纯化） 通常在提取前先进行过滤，将菌丝体和滤液分开。根据目的产物理化性质的不同采取不同的策略进行分离纯化。如离子交换、凝胶色谱、亲和层析等。基因工程菌产生的外源蛋白通常会形成不溶解的包涵体，因此还需设法回收包涵体，使之复性。 发酵工程除了这几个基本过程外，对发酵产品而言，还有按产品的标准进行成品检定和按商业要求进行成品分装等工序。另外还有发酵后废物的处理等问题。

8.3 发酵操作方式 连续发酵 分批发酵 补料分批发酵 发酵方式的分类有好多种，如根据需氧情况的不同可分为需氧发酵和厌氧发酵；根据培养基的相态分为液相发酵和固相发酵；根据发酵是在培养基表面或深层进行的分为表面发酵和深层发酵；按菌种是否被固定在载体上又可分为游离发酵和固定化发酵；按菌种的种类是否单一又可分为单一纯种发酵和混合发酵；而按发酵工艺过程的连续性则分为连续发酵和分批发酵。 分批发酵是相对连续发酵而言，它包括简单分批发酵、补料分批发酵和反复补料分批发酵三种类型。 工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批培养或分批补料培养这两种方式。在微生物制药工业上更是如此。 目前常规的微生物培养发酵操作方式有三种：分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。 补料分批发酵

连续发酵 是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持稳定，微生物在稳定状态下生长。 连续发酵目前主要用于研究工作中，如发酵动力学参数的测定，过程优化条件的试验等，在工业生产中的应用还不多。 连续发酵是个开放的系统，通过连续流加新鲜培养基并以同样的流量连续排出发酵液，可使微生物细胞群体保持稳定的生长环境和生长状态，并以发酵中的各个变量都能达到恒定值而区别于瞬变状态的分批发酵。 以发酵中的各个变量都能达到恒定值而区别于瞬变状态的分批发酵。

连续发酵的优点 可维持稳定的操作条件，从而使产率和产品质量也相应保持稳定； 能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度； 减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率； 容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。

缺点 是开放系统，加上发酵周期长，易造成杂菌污染； 在长周期连续发酵中，微生物易发生变异，生长慢的高产菌株可能逐渐被生长快的低产变异株取代，从而使产率下降； 粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长及在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难。 所以才主要在研究工作中使用，具体的工业化生产并不采用这种方式。

分批发酵 将全部的营养和菌种一次加入进行培养，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的发酵操作类型。 不能维持一定的菌体浓度，当基质耗尽后菌体将加速死亡，使活细胞含量迅速下降。 一次投料，一次接种，一次收获 间歇培养 它是一种传统的发酵方式，在简单分批发酵过程中，微生物的生长、各种营养物质的消耗和代谢产物的合成时刻处于瞬变之中，即整个发酵过程处于不稳定状态。 每进行一次培养都要经过灭菌、装料、接种、发酵、放料等一系列过程，因此，非生产时间长，生产成本较高。

补料分批发酵 分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式 在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加C源或N源或其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次全部放出。 技术介于两者之间，兼有两者的优点，又克服了它们的缺点。 可持续地共给菌体维持和生长所需的营养，故能保持发酵液中有较高的活菌体浓度；另外，不断的补料稀释，对降低发酵液黏度，强化好氧发酵的供氧，也十分有利。因此，补料分批发酵目前已广泛用于各种发酵产品的工业化生产中。 但由于发酵液的不断增加，受发酵罐操作容积的限制，发酵周期只能控制在较短的范围内。 在操作上它可分为简单分批发酵的生长阶段和补料分批发酵的生产阶段。

8.4 下游加工过程 从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。是发酵生产中最重要、成本费用最高的环节。 一般可分为四个阶段： 1、发酵液预处理和固液分离 2、提取 3、精制 4、成品加工 如： 目的产物是分泌到胞外的酶，则需从发酵液中提取；若产物为胞内酶，则需在细胞与发酵液分离之后，进一步破碎细胞，以释放出胞内物质，再利用其特定的理化性质制定相应的分离纯化方法，如离子交换、凝胶色谱等。

要点 一个典型的发酵过程要包括哪些步骤？ 三种主要的发酵方式？ 发酵产物有哪些类型？