植物生物技术 河南农业大学生命科学 学院植物科学系

绪论 第一部分 植物组织培养 第二部分 植物基因工程 第三部分 植物分子标记 第一章 植物离体遗传操作技术 第二章 胚器官培养 第一部分 植物组织培养 第一章 植物离体遗传操作技术 第二章 胚器官培养 第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化 第四章 植物体细胞无性系变异与植物改良 第五章 原生质体培养和体细胞杂交 第六章 单倍体细胞培养 第二部分 植物基因工程 第七章 植物基因克隆的原理与技术 第八章 植物遗传转化 第三部分 植物分子标记 第九章 分子遗传标记

第四章 植物体细胞无性系变异与植物改良

主 要 内 容 第一节 体细胞无性系变异概念与特点 第二节 体细胞无性系变异的遗传基础 第三节 影响植物体细胞无性系变异的因素 第一节 体细胞无性系变异概念与特点 第二节 体细胞无性系变异的遗传基础 第三节 影响植物体细胞无性系变异的因素 第四节 体细胞无性系变异的应用 第五节 植物种质资源离体保存

第一节 体细胞无性系变异概念与特点 一、概念 LarkinScowcroft（1981）提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones）。 在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象，称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。

二、变异主要涉及两个方面 表型变异 包括形态特征、生长习性、抗性等 染色体变异 数目、结构

三、体细胞无性系变异的主要表现 1、 培养细胞的形态结构及生长能力的变化 不同的培养条件下棉花细胞的形态结构

2、 细胞器官分化或体细胞胚胎发生能力的改变 长期继代培养容易导致植物愈伤组织丧失胚胎发生能力

3、 再生植株形态特征和性状的变化

四、体细胞无性系变异的特点 1、变异广泛 体细胞无性系变异是组培中普遍现象。包括数量性状、质量性状、染色体数目和结构变异，ＤＮＡ扩增和减少，生化特性变化等，以数量性状变异为主。 2、变异频率高 体细胞无性系变异频率显著高于自然突变。 3、后代稳定快 一般无性系二代就可获得稳定株系，这是优良性状选择的关键时期，从而大大地缩短育种年限。

4、潜在的隐性性状和显性性状的活化。 在无性系变异后代不但出现显性性状的改变，常出现一些供体植株所没有的隐性性状的变异如雄性不育、矮杆等。 5、起点高，效率高。 选用现行最好的品种（系），作为起始材料，一旦选育出就能超过现有的品种，不需要多年的适应性试验。 6、体细胞无性系变异与外植体来源及培养时间有关。

五、体细胞变异的优缺点： 优点： 适用于各种组培植物； 持续快速提供变异源； 消除优良品种的一个或几个缺陷； 提供新型变异株系。 缺点： 继代多次后，植株再生能力减弱； 变异不稳定，杂交或自交后发生变化； 变异没有可预见性，常产生不适变异。

六、体细胞无性系变异的诱导与离体筛选 （一）体细胞无性系变异的筛选的优点 可以小空间内对大量个体进行选择； 筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制； 诱变和筛选条件可精确控制，试验重复性好； 突变体来源于单细胞，避免了植株出现嵌合体； 在细胞培养系统中，诱变剂可较均匀地接触细胞，突　 变率高，选择机会多。

（二）步骤 诱变材料的选择 自发变异 细胞诱变 突变体筛选 突变体稳定性鉴定

1、诱导起始材料的选择 目标性状 的可行性 选择 起始 材料 原则 试验植物 细胞培养 技术水平 适当的 细胞类型

2、自发突变 　　一般来讲，长期营养繁殖的植物、培养时间较长或继代次数多等，均容易出现较高的变异率。另外，培养类型中，原生质体、细胞、愈伤组织培养等所出现的变异频率要高于组织或器官培养的变异。

3、诱变 物理诱变 化学诱变 转座子插入 对培养细胞用各种诱变剂处理，可以提高培养细胞突变率10～100 倍[杜秀达 等1979 ] 。

物理诱变 常用的射线处理包括：X射线、Y射线、快中子、紫外线等。选择辐射类型应根据培养类型进行。 化学诱变 常用的化学诱变剂： - 烷化剂如DES，可改变DNA结构而引起突变；烷化剂 甲基磺酸乙醇( EMS) 是植物最有效的化学诱变剂之 一。 - 碱基类似物，核酸复制时，可掺入到新合成的DNA分 子中引起错配； - 移码诱变剂，如ICR化合物。

转座子插入诱变 转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞诱变方法。转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。 目前，使用较多的转座子体系是玉米的Ac/Ds系统。首先采用基因转化的方法将Ac/Ds导入受体细胞，再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使Ac因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除Ac的植株中筛选出不同变异。利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。

4、突变体选择 直接筛选 间接筛选

在进行突变体筛选之前，首先应确定采用的抑制剂的浓度，即利用多大剂量的筛选剂较合适。 4.1 直接选择（选择压） 其方法是在培养过程中给予培养材料一定的选择压力，如盐类、病菌毒素、除草剂等，使非目标变异体在再培养过程中被淘汰，而符合人们要求的变异体得以保留和表现，起到定向培育作用。 贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4%NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。 郑企成等曾将小麦“京花1号”花药经γ射线处理后，再经0.5NaCl培养基直接筛选出耐盐再生株系。 在进行突变体筛选之前，首先应确定采用的抑制剂的浓度，即利用多大剂量的筛选剂较合适。

采用正向选择法时可考虑两种选择方案，即一步筛选法和多步筛选法。 筛选的材料对象可以是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物。

当前在农业上，体细胞突变体筛选技术研究主要集中在抗病、 抗盐、抗除草剂、抗低温、高温等逆境胁迫的突变体筛选。 另外，在提高作物营养物质（如蛋白质、赖氨酸等）改变作物品质方面也取得了一定进展。

4.2 间接选择 间接选择是一种借助于与突变表现有关的性状作为选择指标的筛选方法。 Dorffling等以羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。 林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经γ射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，其再生植株抗寒性比供体植株提高2.4℃。

5、突变体稳定性鉴定 突变细胞或组织鉴定 在正常培养基上继代培养几次进行鉴定。 突变植株鉴定 当代鉴定或自交后代鉴定

第二节 体细胞无性系变异的遗传基础 体细胞无性系变异可分为可遗传的变异（heritable variation）和外（后生）遗传变异（epigenetic variation），前者在有性和无性繁殖世代稳定保持变异；后者在有性世代，即使在无性世代也不能稳定保持变异。 可遗传的变异，一般认为有其遗传基础。 （DNA的化学结构变化可能影响基因的表达，而没有改变DNA的实际序列，这些变化会代代相传，这种现象叫做后生遗传修饰)

1. 外植体中预存的变异 在自然界中正常生长的植物体的某些组织内, 不同程度地存在自发产生的变异细胞. 多倍体、非整倍体和染色体结构变异都有报道。这些外植体中预存的变异是导致培养细胞遗传基础不一致的原因之一.

主要是由于染色体断裂后经过修复和重新连结所形成的易位、倒位、缺失和重复。 2、染色体数量变异 3 、染色体结构变异 主要是由于染色体断裂后经过修复和重新连结所形成的易位、倒位、缺失和重复。 在小麦(Davies 等，1986) 、水稻(凌定厚等，1987) 和大麦(袁妙葆等，1991) 的再生植株中均发现有易位发生。说明染色体结构变异是存在的。 芦笋体细胞变异 大黄体细胞变异

4、细胞脱分化后的细胞异常分裂 有丝分裂发生异常则会直接引起子细胞中染色体的变异。 在胡萝卜、烟草、大蒜等许多植物的组织培养中都观察到有丝分裂异常的现象，主要表现在： ①产生多极纺锤丝及其它纺锤体异常； ②有丝分裂中期染色体不能排列到赤道面上，后期出现落后染色体等； ③染色体融合、染色体断裂，即出现多着丝点染色体和染色体片断； ④体细胞配对，即在愈伤组织细胞的有丝分裂中同源染色体配对，姊妹染 色单体交换和易位等。

5、基因突变 基因突变是指DNA序列中的碱基发生了改变。基因突变被认为是体细胞无性系变异的重要来源之一。 由于基因突变产生的变异较小，一般不会影响植物体的生长发育,所以在植物育种中具有重要的利用价值。 如 Brettell 等(1986a)，从645 株玉米杂种胚培养的再生植株中，发现了一个表现稳定的Adh1(玉米乙醇脱氢酶)位点变异体。

6、 基因扩增和基因丢失 基因扩增: 是细胞内某些特定的基因拷贝数专一性地大量增加的现象，是细胞在短期内为满足某种需要而产生足够的基因产物的一种调控手段。 在离体组织培养条件下，植物基因组会发生扩增和丢失，从而导致性状 改变，表现出变异。 在水稻中，用DNA 重复序列进行的研究发现，一些重复序列在组织培养 中 有显著的选择性扩增(Zheng 等, 1987)，愈伤组织的DNA 重复序列与 叶片 相比有5～70 倍的拷贝数差异，而不同品种的叶片间的差异只有 2～3 倍. 在土豆和六倍体小黑麦的rDNA 分析中，还观察到经组织培养而造成拷贝 数的下降(Landsmann 和Uhrig ，1985 ;Brettell 等，1986b) 。

7、 DNA 甲基化变化与体细胞无性系变异 DNA 甲基化(DNA methylation) 是活体细胞中最常见的一种 DNA 共价修饰形式。DNA 甲基化是指由甲基转移酶介导，以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，在胞嘧啶(C)5 位碳原子上加入一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶的化学反应。

DNA甲基化是后生遗传研究的重要内容之一

甲基化修饰在基因表达、植物细胞分裂以及系统发育中起着重要的调节作用。 DNA 甲基化与基因的转录失活，尤其是转基因( transgene) 的失活、转座子( transposon) 的转移失活等多种后生遗传基因( epigeneticgene) 的失活存在密切的关系[Alan et al. 1999，Aharon et al. 1998， Arnaud et al. 2000] 。

8、 植物转座子活化与体细胞无性系变异 1981 年，Larkin 和Scowcroft 首先提出，转座因子的活化可能是无性系变异的原因之一。以后一些学者对这一观点进行了更为深入的推断(Larkin ,1984 ; Peschke 等,1987 ;Burr ,1988) 。 跳跃基因(jumping gene)：即转座因子，指染色体组上可以转移的基因。 　实质：能够转移位置的DNA片断。 　功能：在同一染色体内或不同染色体之间移动引起插入突 变、DNA结构变异（如重复、缺失、畸变）通过表 现型变异得到鉴别。

9、细胞器DNA 的变化 植物进化过程中，细胞质的叶绿体和线粒体基因组是比较稳定的。 大多数体细胞无性系突变体中，对叶绿体DNA 的研究也发现稳定是基本规律(Kemble 和Shepard ,1984) 。 小麦花药培养中经常出现大量的白化苗，对这些白化苗和对照植株叶片叶绿体DNA 分析，发现叶绿体基因丢失达80 %(Day 和Ellis , 1984) 无性系再生植株的线粒体DNA 变异也有一些报道(Brettell 等,1980 ;Kemble 等,1982 ;Negruk ,1986 ;Schmidt 等,1996) 叶色突变体

第三节 影响植物体细胞无性系变异的因素

一、供体植物 1、生理状态 ¤ 以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体植物的 典型性，体细胞变异频率很低。 ¤ 以分化组织为外植体的再生植株容易发生体细胞变异，其 频率与分化程度有关。 2、遗传背景 ¤ 基因型：植物种基因型间变异频率差异较大。 ¤ 倍性水平：多倍体和染色体数目较多的植物其变异频率比 二倍体和单倍体高。

二、培养基 1、物理状态 一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。 2、激素 培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定的影响。 激素引起的变异大多为倍性增加。 少数情况下激素引起类减数分裂而使倍性减少。

三、培养类型 原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。在细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异要大于体细胞培养的植株。

四、继代次数 由继代次数引起的体细胞变异普遍存在。一般来说，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的机率就越高。 ——烟草继代培养５年的愈伤组织，其再生植株与供体基 因型相比，几乎没有形态正常的植株。染色体分析表 明其大多为非整倍体和多倍体。 ——玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与 供体基因型基本一致，但培养３年后愈伤组织的再生 能力显著下降，再生植株生长异常。细胞学分析显示 染色体断裂和带型变异。

第三节 体细胞无性系变异的检测技术 (一 )细胞学检测 1. 细胞学压片检测染色体形态和数目,以及核型分析检测结构变异 对生物细胞核内全部染色体的形态特征所进行的分析，称为染色体组分析或核型分析。包括对染色体长度，着丝粒位置，长短臂比，随体的有无的描述。

2 . 核DNA相对含量和倍性检测 流式细胞仪( Flow cytometer , FCM) 亦称荧光激活细胞分类仪(FACSC) , 是一种将现代免疫荧光技术与流体力学、激光学、应用电子学和计算机等学科的先进技术相融合用于基础与临床细胞生物学研究的一项高科技实验设备。 流式细胞仪作为细胞分析的研究工具, 能够快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可对其分类收集。

(二 )体细胞变异的分子生物学检测 主要通过无性系的酶谱、限制片段长度多态性（ RFLP ）、随机扩增多态性(RAPD) 和简单重复序列多态性(SSR，又称微卫星DNA) 变化来检测变异的存在。 Feuser et al Genotypic fidelity of micropropagated pineapple (Ananas comosus) plantlets assessed by isozyme and RAPD markers Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72: 221–227, 2003.

第四节 体细胞无性系变异的应用 加强外源基因向 栽培种的渐渗 改良作物品种 拓宽种质资源 遗传学研究 代谢研究 发育生物学研究

一、改良作物品种、拓宽种质资源 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。 在全世界50多个国家中已发放了1000多个由直接突变获得的或由这些突变相互杂交而衍生的品种。

在各国现有通过体细胞诱变选育的谷类作物品种中，品质得到不同程度改良的占34.3%。 在水稻方面，国外至少育成了12个米质优良的品种。如法国选育的Delta，以其良好的籽粒品质占该国水稻总面积的20%。 此外，还有丹麦无花青素原大麦Galant。 据不完全统计，诱变品种中大约有1/4是抗病品种，其中80%左右为抗真菌品种。 耐盐、抗旱、抗寒变异也已筛选出众多中间材料，有的已进入区域试验，有的已用于生产。

二、加强外源基因向栽培种的渐渗 对远缘杂交的体细胞杂种、单体异附加系和异代换系等材料进行组织培养，能使它们发生遗传交换，提高外源基因向栽培种渐渗。

三、遗传学研究 突变体直接用于基因功能鉴定 突变DNA序列用作分子标记进行遗传研究 -----利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基因，如玉米乙醇脱氢酶基因ADH，赤霉素合成相关基因、生长素敏感性基因等。 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。 在全世界50多个国家中已发放了1000多个

四、发育生物学研究 利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究已在模式植物拟南芥和金鱼草等植物中广泛开展，并分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体。 以突变体为工具，还从组织学和细胞学角度分析鉴定了一些基因的表达与植物发育的关系。 在烟草、玉米中均通过质体突变体分离鉴定了与植物叶绿体发育有关的核基因。玉米黄化突变体pun是一个在光照下不可逆转的突变体，分析显示，该突变体为一核单基因隐性突变，该基因的突变扰乱了叶绿体基因编码的蛋白质积累，进而使叶绿体膜系统发育不足，类囊体相关蛋白不能积累。 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。 在全世界50多个国家中已发放了1000多个

五、代谢途径研究 突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分便利和高效的优势。可根据需要建立某一代谢途径中每一个调节点的突变体，也可以与基因工程相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造，使代谢过程按照人类需要进行。因此而发展起来的新型学科领域称之为代谢工程。 近年来，通过体细胞突变研究激素、次生代谢产物等代谢途径的研究已有许多报道。如番茄推迟成熟的突变体Nr，与乙烯应答基因突变有关；玉米胚乳皱缩型突变sh可能涉及蔗糖代谢的相关酶基因的突变。 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。 在全世界50多个国家中已发放了1000多个

第五节 植物种质资源离体保存 一、概念 是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。

二、保存方法 保存方法有两种：限制生长保存和超低温保存种质 （一）限制生长保存 1、低温保存法 是限制生长保存中应用最广的方法。培养温度一般为1-9℃（热带、亚热带植物则一般为10-20 ℃ ），同时提高培养基的渗透压，培养物的生长受到抑制，继代时间可延长间隔数月到1年以上。 2、高渗透压保存法 3、生长抑制（或延缓剂）保存法 如加入ABA、矮壮至少、多效唑等 4、降低氧分压保存法 5、干燥保存法 对培养物台愈伤或体细胞胚进行脱水处理，然后置于特定的培养基条件下保存。

（二）超低温保存种质 1、概念：是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法。 2、超低温保存的基本原理 离体种质在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止，因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。 低温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结构。因此在冰冻过程中，通过避免或尽量减少其细胞内水分结冰而达到冰冻保存的目的。

3、超低温保存的基本程序 植物材料（培养物）的选取 材料的预处理 冷冻处理：分慢冻法、快冻法、预冻法、干冻法 冷冻贮存 解冻：分快速解冻、慢速解冻 再培养

三、离体保存种质的遗传完整性 影响离体保存种质遗传完整性的主要因素 外植体类型 培养基成分 保存方法 保存时间

四、优缺点 1、优点 所占空间少，节省大量的人力、物力和土地； 便于种质资源的交流利用； 需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖； 避免自然灾害引起的种质丢失。 2、缺点 对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养； 易受微生物污染或发生人为差错； 多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料和分化和再生能力的降低。 ----超低温保存可在一定程度上避免这些问题。

思 考 题 体细胞无性系变异的应用。 影响植物体细胞无性系变异的因素。 体细胞无性系变异的特点。 体细胞变异的优缺点。

谢谢! （本章内容结束）