基因工程原理 主讲 刘丽华

考核方法 考勤 平时成绩 20% 100% 名词解释 20% 闭卷考试 80% 填空、判断 40% 简答、论述 40%

《基因工程原理》 第一章 导 论 第二章 基因操作的工具酶 第三章 基因克隆的载体 第四章 基因克隆的策略 第五章 克隆基因的表达 第一章 导 论 第二章 基因操作的工具酶 第三章 基因克隆的载体 第四章 基因克隆的策略 第五章 克隆基因的表达 第六章 基因工程的基本技术-1

《基因工程原理》 第七章 基因工程的基本技术-2 第八章 酵母菌的基因工程 第九章 植物的基因工程 第十章 动物的基因工程

第一章 导 论 第一节 基因工程的诞生 第二节 基因工程的研究内容 第三节 基因工程的成就和前景展望 第四节 基因工程的安全性分析

细胞的发现

进化论的提出 1859年《物种起源》

Mendel 和遗传规律的研究 Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。

1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律

发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的 概念。 基因概念的提出 1909年Yohannsen W.L. (1859-1927) 发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的 概念。

1910年以后，Morgan T.H.等提出了基因的连锁遗传规律，染色体遗传理论发展为《细胞遗传学》 连锁遗传规律的提出 1910年以后，Morgan T.H.等提出了基因的连锁遗传规律，染色体遗传理论发展为《细胞遗传学》

1941年，Beadle G.W.等证明了基因通过酶起作用，提出了“一个基因一个酶”的假说

第一节 基因工程的诞生 一般认为 1973年是基因工程诞生的元年 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 第一节 基因工程的诞生 一般认为 1973年是基因工程诞生的元年 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。

1944年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验 1、DNA是遗传物质被证实 1944年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验

40年代，证实DNA是遗传物质 1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。 早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？ 1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。 （1）S型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，65℃ 加热：注射小白鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。 （4） 65℃ 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。

40年代，DNA是遗传物质被证实 1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。 （1） S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌； （2）经DNase 处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。 （3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。 不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。

2、DNA双螺旋模型的提出 Watson 和Crick

50年代，DNA的双螺旋模型的提出 和DNA复制机理的阐明 DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。 1953年，Francis Crick和James Watson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。

3、“中心法则”的提出 Nireberg等为代表的 一批科学家

60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则） 既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？ 以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。

1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 原核生物的基因调控操纵子模型 1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 操纵子模型 （operon model）。

第一节 基因工程的诞生 一般认为 1973年是基因工程诞生的元年 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 第一节 基因工程的诞生 一般认为 1973年是基因工程诞生的元年 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。

Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内切酶。 1、工具酶的发现和应用 Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内切酶。

1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。 1、工具酶的发现和应用 1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。

1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。 2、反转录酶的发现和应用 1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。

1972年，美国Stanford大学的P. Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组； 3、载体的发现及其应用 1972年，美国Stanford大学的P. Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组；

1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。 3、载体的发现及其应用 1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。 这一年被定为基因工程诞生的元年。

基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化 Cohen等的重组实验示意图 Tcr Ner Eco RI 连接酶 Tcr 双抗重组菌落 Eco RI Ner 基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化

第一节 基因工程的诞生 一般认为，1973年是基因工程诞生的元年。 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 第一节 基因工程的诞生 一般认为，1973年是基因工程诞生的元年。 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。

第一章 导 论 第一节 基因工程的诞生 第二节 基因工程的研究内容 第三节 基因工程的成就和前景展望 第四节 基因工程的安全性分析

与基因工程相关的几个概念 生物工程 biological engineering 遗传工程 genetic engineering 基因工程 gene engineering 分子克隆 molecular cloning 基因克隆 gene cloning 基因操作 gene manipulation 重组DNA技术 recombinant DNA technique 克隆（clone） 酶工程 农业工程 发酵工程 细胞工程 有性杂交 诱变育种 体细胞融合

什么是克隆（Clone） 作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的工程。 所以，植物的无性繁殖（如马铃薯的生产）、细菌的无性繁殖以及重组DNA分子通过工程菌的繁殖等过程都是一个克隆的过程。 那么，克隆动物是怎么回事呢？

基因工程的概念 一般来说，基因工程是在体外将目的DNA（来源可以是动植物和微生物）和某一载体（DNA）系统进行重组，再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。

广义基因工程： 由上游技术和下游技术组成，上游技术指的是外源基因重组、克隆、和表达的设计与构建；下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养及外源基因表达产物的分离纯化过程。

基因工程研究的基本步骤 1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段） 2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到 重组DNA分子。 繁殖，从而使得目的基因得到扩增。 5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如， 序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究 和利用等。

基因工程的基本流程 基因和载体连接 载体酶切 基因分离酶切 导入植物细胞 重组克隆的选择 导入细菌 序列分析和基因表达等研究 重组质粒繁殖

基因工程技术路线 切 接 转 选 表达 1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备） 2、DNA片段和载体的连接 4、选择基因（目的基因） 5、目的基因表达 切 接 转 选 表达

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基因工程的兴起 1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量。 1978年， Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。 1979年， Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。 1980年， Nagata等， 遗传工程菌生产干扰素获得成功。 1981年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。 1982年， 重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。 1983年， 基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。

植物转基因育种的发展优势 1、扩大了作物育种的基因库 转基因育种打破了常规育种的物种界限，来源于动植物和微生物的有用基因都 可以导入作物，培育成具有某些特殊性状的新型作物品种。 2、提高了作物育种的效率 作物转基因育种不仅大大缩短育种年限，而且可成功地改良某些单一性状却不 影响改良品种的原有优良特性。 3、减轻了农业生产对环境的污染 转基因抗虫棉花的大面积种植和推广，不仅可以减少化学杀虫剂对棉农及天敌 的伤害，而且可以大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，随着高 效固氮转基因作物及高效吸收土壤中磷元素等营养元素的转基因作物不断问世 和推广，农用化肥的利用率将极大地提高，这对减少农田污染具有重要意义。 4、拓宽了作物生产的范畴 各种有价值的蛋白产品都可以利用植物反应器进行高效生产，番茄、马铃薯、 莴苣和香蕉等作物已被成功用于生产口服疫苗。另外，各种工业原料，比如纤 维素、海藻糖和可降解塑料等也可以用植物来生产。有人甚至预言，除了钢筋 混凝土之外，未来的转基因作物将可能生产出人类所需要的一切产品。

基因工程用于基因治疗 　　人体基因的缺失，导致一些遗传疾病，应用基因工程技术使缺失的基因归还人体，达到治疗的目的，已成为基因工程在医学方面应用的又一重要内容。

美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。                                                                          美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。 谢德尔，1999 1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。

我国基因工程部分研究进展 转基因抗病虫植物　 我国科学家将抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著，现正进行田间加代繁殖。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。 基因工程疫苗 乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿 1千万人，其中40％左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。

基因工程药物 干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。 动物克隆和转基因研究 16日，“神舟”五号成功着陆的同一天，包括两头转基因体细胞克隆牛在内的10头体细胞克隆牛现身山东梁山县。我国转基因体细胞克隆技术及体细胞克隆技术的研究与应用达到国际前沿水平。 3月25日出生的体细胞克隆牛“乐娃”，由于成功地转入了绿色荧光蛋白基因，成为我国首例转基因体细胞克隆牛，标志着我国在转基因体细胞克隆技术方面的新突破。

10月4日，第二头转基因体细胞克隆牛“岩娃”的呱呱坠地，同时创造了两个世界首次，即首次获得了用于治疗人类胃溃疡疾病的转有人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛；首次获得了在同一头牛中转有3种外源基因的转基因体细胞克隆牛。这标志着我国已经成熟掌握了转基因体细胞克隆牛的生产技术体系，在该领域的研究跻身于世界的前列。 岩藻糖转移酶催化形成的抗原物质可以特异调节幽门螺旋杆菌与人胃上皮细胞结合。而幽门螺杆菌正是慢性浅表萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃增生性息肉、胃癌等重要致病菌，被国际卫生组织列为一类致癌病原。据世界卫生组织公布，世界人口的50 %～80 %均感染了幽门螺杆菌，在中国，达到70%。由于岩藻糖抗原仅仅存在于人类和灵长类的动物体内，通过转基因克隆方法将人岩藻糖转移酶基因转入牛基因组内，牛奶中表达产生岩藻糖抗原。转基因牛奶可以作为一种口服药物达到治疗或预防胃病的目标。

新世纪的好消息 科学家说，在下个世纪，我们将能够从根本上改变ＤＮＡ，在创造出新生命形式的同时把我们的幻想和虚荣心编成代码。我们的孩子也许能选择下一代的特征———选择他们的性别、眼睛的颜色，操纵他们的智商、个性和运动能力。他们也许能克隆自己、或者某一个子女、或者他们崇拜的某一位名人，甚至可能在我们死后克隆我们，自那头名为多利的克隆羊诞生以来，很少有人怀疑克隆人会在２０２５年之前诞生。那样一来，性器官与繁殖后代之间的联系将被打破。人们只需从自己的身体上切下一小部分，就能生长成一个新的个体———就像柳树那样。 这个星球的科学家们，都投入了对未来的憧憬中，用他们超乎常人的眼光，预测２１世纪人类的前景。

新世纪的好消息 　　美国加州技术学院的本泽和他的学生首次发现了“时钟基因”，该基因控制着每一个活细胞的生命时钟进程。最近他发现一种发生基因突变的果蝇的寿命比其它果蝇长三分之一，而这种差异仅仅是由一条单独的基因造成，本泽称它为玛士撒拉（Ｍｅｔｈｕｓｅｌａｈ，《圣经·创世记》中人物，据传享年９６５岁）。既然果蝇的寿命能通过一条基因来延长，那我们也可以大胆地预言，下个世纪，科学家们将找到调整人类生命时钟的方法。

第一章 导 论 第一节 基因工程的诞生 第二节 基因工程的研究内容 第三节 基因工程的成就和前景展望 第四节 基因工程的安全性分析

基因工程的安全性分析 　　有关基因工程安全性的争论一直伴随着基因工程的诞生与发展。对于基因工程安全性的担心主要来自科学界，社会公众也有不同程度的关注。重组DNA技术的创始人之一P.Berg教授首先注意到这一问题，而没有进行将SV40基因引入大肠杆菌的实验。他们认为这种重组DNA分子有可能从实验室逸出，甚至会随大肠杆菌感染人类，引起不可预料的后果。社会公众担心重组DNA技术被大量应用，会制造出各种新型的微生物，威胁人类的健康甚至生存。而有些科学家则认为，自然界中类似的重组一直在自然发生，新的微生物物种不断产生。因此，对重组DNA技术没有必要过分担忧，采取一些相应的措施即可。

　　随着基因工程在农业中的广泛应用，各种转基因作物被培育和种植，一些负面报道相继出现。1998年生物学家普兹泰在英国的电视节目中公布了他的一项实验结果，用转基因马铃薯饲喂老鼠后，老鼠的器官生长异常，体重减轻，免疫系统受到破坏。这一结果的公布，引起英国公众对重组DNA技术和转基因作物极大恐慌。于是，英国皇家学会组织同行科学家对该实验进行评审。评审结论是普兹泰的实验从设计、执行到分析等6个方面都存在缺陷，不应过早得出喂食转基因土豆是老鼠发育异常的直接原因。尽管如此，仍不能消除该事件的负面影响。

主要问题: 1.用于筛选的标记基因是否会被病原菌摄取而导致其抗药性的提高. 2.抗除草剂基因是否会使转基因植物变成不可控制的杂草,或飘移到杂草上使之泛滥. 3.外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达. 4.转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种. 5.基因治疗是否会对人体的正常功能产生不良影响. 那么，基因工程真的会给人类带来灾难吗？大多数科学家对次项新技术持乐观的态度，因为经过30多年的发展，迄今为止尚未发生重组DNA的危险案例。这一事实说明重组DNA不是洪水猛兽，人们对转基因技术的恐惧是缺乏事实根据的。但是正如人们所担心的，基因工程确有其不完善之处。首先，基因漂移可能会给人类和环境带来潜在的、长期的影响。如用于筛选的标记基因或报告基因有可能被病原菌摄取而导致其抗药性的提高；抗除草剂基因可能使转基因植物变成不可控制的超级杂草，或漂移到其它杂草上使其泛滥。而且这些基因一旦释放出去就难以收回。它不象核污染、化学污染那样，随时间的延续和距离的增加而减轻危害的程度。以目前的科学技术水平还不能对这种潜在的危害作出准确的预测。 其次，重组DNA导入受体生物细胞后具有不可控性。如外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达；转基因生物是否会演变成对入类有极大威胁的新物种；基因治疗是否会对人体的正常功能产生不良影响等等；这些都难以下定论。另外，转基因生物本身也有一些缺陷。如耐储藏的转基因番茄，失去了多汁的好口感。

基因工程的安全措施 　　l 976年6月23日，美国国家卫生研究院制订并正式公布了“重组DNA研究准则”(以下简称“安全准则”)。 “安全准则”除了规定禁止若干类型的重组DNA实验之外，还制订了许多具体的规定条文。例如：在实验安全防护方面，明确规定了物理防护和生物防护两个方面的统一标准。物理防护分为P1一P4四个不同等级，生物防护则分为EKl一EK3三个不同的等级。 为了最大限度地发挥基因工程优势，限制其弊端，确保基因工程研究和应用的安全性，促进基因工程的正常快速发展，保障人类健康，防止环境污染，维护生态平衡，各国相继出台了一系列基因工程研究法规．以加强对基因工程研究安全性的管理。

物理防护 　　P1—P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。P1级实验室，为一般装备良好的普通微生物实验室；P2级实验室，是在P1级实验室的基础上，还需装备负压安全操作柜；P3级实验室，即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜；P4级实验室，是具有最高安全防护措施的实验室。要求建设专用的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔离带，细菌操作需带手套进行，以及使用其它必要的隔离装置，使研究者不会直接同细菌接触等等。

生物防护 　　生物防护方面，EKl—EK3级是专门针对大肠杆菌菌株而规定的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为前提制定的。EKl级的大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都是要死亡的．而符合EK 2—3级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无法存活的。

思 考 题 什么是基因，它和细胞、染色体的关系如何？ 为什么认为1973年是基因工程诞生的元年？ 上世纪40—70年代初分子生物学领域理论上和技术上的哪些重大突破对于基因工程的诞生起到了决定性的作用？ 什么是克隆，你知道当前动物克隆的基本原理么？它和植物的克隆有何区别？ 在你的脑海中，基因工程的基本流程是怎样的？ 植物转基因育种比起常规育种来有哪些优势？你知道转基因育种的不足吗？