DNA回收纯化及重组体的构建

实验目的和要求 学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术。 本实验采用粘末端连接法将载体外源基因连接。 掌握DNA重组方法。通过本实验了解DNA重组技术在分子生物学研究中的重要意义。

相关基础知识 DNA片段的纯化： DNA纯化的主要目的是回收得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速度。

DNA重组 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进行研究。结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、干扰素等。

载体的选择： 因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。

DNA连接酶 主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。E. coli DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步。

T4噬菌体DNA连接酶还有一种E. coli DNA连接酶没有的特性即将两个平末端的双链DNA分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。

对于T4-噬菌体DNA连接酶的活性测定至少有三种以上的方法： Weiss单位（Weiss等,1968），是指在37oC下20分钟内催化1nM 32P从焦磷酸根置换到[,-32P] ATP所需酶量； （NEB公司，粘性末端）将1g由HindIII酶解的DNA的12碱基对粘性末端在160C条件下、30分钟、20l反应体系中连接50时所需酶量。 (Takara公司)在20l的反应体系中，6g的DNA-HindIII的分解物在160C反应30分钟时，有90以上的DNA片段进行连接的酶的活性为1U。 相当于 ATP-Ppi交换反应中0.008 Weiss U。

连接 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。

粘末端连接法 若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。

平端连接法： 待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除3突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率 。

另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体5-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。 综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为EcoR I ，另一端为BamH I，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。

载体及插入片段的量 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。

实验材料与仪器： DAN和载体的酶切产物 标准分子量片段 琼脂糖 T4 DNA ligase 及其缓冲液(Takara,350u/l) TBE缓冲液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(3×) 电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等

实验方法和步骤 酶切产物的纯化---乙醇沉淀---电泳检测---连接---160C过夜

DNA重组 本实验是将具有 EcoR I 粘性末端的基因片段以及载体通过DNA连接酶连接起来。

将酶切后的 2个DNA片段（有时需要在70oC加热15分钟使酶失活及酚氯仿抽提），然后按载体：待插入DNA片段＝1：2（摩尔）混合于一管中（载体可用50-100ng，对于本实验约2 µ l载体，4 µl DNA片段，根据电泳结果来判断 ） ，加入T4 DNA连接酶缓冲液1µl，最后加T4噬菌体DNA连接酶1µl(5单位)，一般掌握在总体积10 µl。

连接体系： 于16℃保温 14～16h（过夜）， 应迅速作转化实验，如遇到特殊情况，可先置于-20oC保存。 然后，通过转化细菌来鉴定反应连接产物。 pUC19 2 µl λDNA 4 µl T4连接酶 2 µl 10xbuffer 1 µl H2O 1 µl 10 µl