饥饿条件下草鱼 ghrelin和cholecystokinin 基因mRNA表达量的变化研究 2011.08.26

研究背景 1.Ghrelin的研究进展 生长激素释放肽、胃饥饿素 1999年，Kojima等从鼠胃中分离出的一种脑肠肽。 第三种调控生长激素分泌的多肽。（GHRH、SRIF） 其它功能：调节摄食、生长和脂肪沉积。

2. Cholecystokinin（CCK）的研究进展 胆囊收缩素 广泛生物学活性的脑肠肽，主要分布于胃肠道和中枢神经系统。 CCK是一种重要的食欲调节饱感因子，当动物摄食之后，其体内的CCK含量迅速增加，抑制动物的进一步摄食。 其它功能：收缩胆囊、促进胰酶分泌、调节胃肠运动、促进胰岛素和生长激素分泌。

研究对象 草鱼 “四大家鱼”之一，传统的养殖品种。

研究意义 1.初步探索两种基因在草鱼饥饿和摄食状态下表达量变化，查明其在草鱼摄食过程中所起的作用； 2.为下一步在实际生产应用中奠定基础； 3.在实验过程中掌握一些实验方法（RNA提取，PCR），提高动手能力。

实验内容： 一、草鱼组织总RNA的提取 二、逆转录获得cDNA 三、PCR及半定量RT-PCR检测mRNA表达 量的变化

一、草鱼组织总RNA的提取 1.实验原理 RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与细胞核中。获得高纯度和完整的RNA是许多分子生物学实验所必需的，这关系到后续实验能否顺利进行。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。在通过氯仿、异丙醇等有机溶剂处理，得到纯化的总RNA。

RNA酶： 如何阻止RNA酶污染？ RNA酶广泛存在而稳定，反应一般不需要辅助因子； 耐受各种处理（如煮沸、高压灭菌等 ）而不被灭活。 内源性：体内 外源性：外界（空气中、汗液、唾液） 来源 如何阻止RNA酶污染？

2.仪器和试剂 仪器 高速冷冻离心机、电泳仪、核酸定量光度计、凝胶成像系统、移液器、枪头、EP管、玻璃匀浆器、剪刀、镊子 金属及玻璃仪器洗净后置于160℃烘烤4h以上；枪头经0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯 ）浸泡过夜后，高温高压灭菌，烘干使用。

试剂 Trizol 氯仿 异丙醇 75%乙醇 无RNase水

3.实验步骤 （1）匀浆 取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠或脑30-50 mg，放入玻璃匀浆管中，然后加入500ul Trizol，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状态； （2）把匀浆液吸入离心管中，加入100ul 氯仿，盖紧管盖，用力摇晃离心管15s，待溶液充分乳化后，室温放置5min； （3）4℃，12000g 离心15 min； （4）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即；无色上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至另一新的离心管（切勿吸出白色中间层，宁缺毋滥！！！）；

（5）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温放置5 min； （6） 4℃，12000g离心10 min； （7）小心弃去上清，缓慢地沿离心管加入75% 乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀； （8）4℃，12000g离心5 min，弃上清，室温干燥5 min；（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇） （9）加入30 ul 无RNase水洗涤沉淀，可用枪头轻轻吹打沉淀。

新鲜组织30~50mg 无RNase水溶解 加入500ul Trizol匀浆 干燥 加入100ul 氯仿 弃上清保留沉淀 振荡混匀 4℃,12000g离心10min 弃上清，向沉淀中加入1ml 75%乙醇洗涤 室温放置5min 4℃,12000g离心15min 4℃,12000g离心10min 加入等体积异丙醇 上清液转移至新的离心管中 室温静置5min

RNA质量检测 纯度的检测 取2 ul RNA加入98 ul DEPC水，测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 RNA浓度计算 浓度= 稀释倍数×读数

完整性的检测 取2ul RNA，与1ul 核酸染料混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

注意事项： 全程佩戴一次性口罩和手套，防止外源性RNA酶污染； 解剖鱼的时候要迅速，减少组织RNA与外界的接触时间； 塑料制品和枪头避免交叉污染。

思考题 1.提取RNA过程中应该注意的环节？ 2.影响RNA纯度的因素有哪些？ 3.RNA提取过程中，各种试剂的作用？

二、逆转录 1. 原理 以RNA为模板，在反转录酶(M-MLV)的作用下，以dNTP为底物合成DNA（cDNA）。

2.步骤 （1）取2ug（y ul） 总RNA 于200ul EP 管中，再加 入（12.25-y）ul DEPC处理的水。 （2）65 ℃， 5min, 立即冰浴3 min （3）依次加入 5 ×RT buffer 4ul Oligo dT 1ul M-MLV 0.5ul RNasin 0.25ul dNTP 2ul （4）42℃， 1 h （5）95℃， 5min （6）16 ℃ ，1min，-20 ℃保存

三、 PCR的原理及其步骤 （Polymerase Chain Reaction） Kary B. Mullis 1983年，“PCR” 想法 1986年， “PCR” 机器出现 1993年，获得诺贝尔化学奖

(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链; 1.实验原理 PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种选择性体外扩增DNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(60℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶作用下，以目的DNA为模板进行合成。 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。

PCR 5’ 3’ 5’ 3’ Mg++ Mg++ Mg++

2.仪器及试剂 仪器耗材 试剂 离心机、PCR仪、电泳仪、移液器及吸头、PCR管 模板DNA 引物 dNTP MgCl2 10 X Buffer Taq DNA聚合酶 灭菌双蒸水

3.PCR加样 简写 试剂 使用量（μl） H2O ddH2O 13 反转录产物 1 B 10×PCR Buffer 2 N dNTP（10mmol/l） 0.4 T Taq酶（1U/μl） 上游引物F（10μmol/l） 下游引物R（10μmol/l） M MgCl2（25mmol/l） 1.2 Total Volume 20

PCR扩增反应条件 预变性 95℃，3min 变性 94℃，30s 退火 56℃，30s 延伸 72℃，30s 延伸 72℃，10min 30个循环 反应结束后，取5ul PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测。

思考题 1.简述PCR基本原理？ 2.进行一次成功的PCR反应需注意哪些问题？ 3.试分析产生非特异性扩增的原因，如何减少非特异性扩增？

四.基因表达的定量研究 1.荧光定量PCR（ real-time PCR ） 2.半定量PCR 选择一个管家基因作为标准，以消除试验误差。 β-肌动蛋白（β-actin） 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH） 18S核糖体RNA（18S rRNA） 延长因子1a（EF1a）‥‥‥

理想的管家基因应具备的条件 不存在假基因，以避免基因组DNA的扩增； 高度或中度表达，排除太高或太低表达； 稳定表达于不同类型的细胞核组织，且表达量是近似的，无显著性差异； 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

半定量PCR 使用凝胶定量软件Quantity One进行凝胶条带的分析。 1.等高线定量法 2.泳道/条带轨迹定量法 通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。 2.泳道/条带轨迹定量法 首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度下面积作为电泳条带的定量标准。