中药与天然产物活性成分的分离纯化 ——技术与策略

生命科学与生物药物的发展 色谱 基因组 蛋白质组 次生代谢产物组 DNA RNA 蛋白质（酶） 基因工程药物 中药活性成分 次生代谢产物 天然产物活性成分

中药与天然产物研究存在的问题 化学成分复杂 有效成分种类很多：生物碱、甙、黄酮、醌、多酚、内脂、香豆素、 数种有效成分并存，并一起作用 萜、有机酸、寡糖、多糖、环肽、甚至蛋白质 数种有效成分并存，并一起作用 合成前体相同，配基链长不等 手性特征差异 含量很低

中药与天然产物分离纯化技术 提取 溶剂分配 超临界萃取 气相色谱 液相柱色谱 高速逆流色谱 New 分离操作 分析或半制备，亲脂性物质 分析，低沸点物质 New 分析、制备、生产，亲水性、亲脂性物质 分析、半制备，亲脂性物质

色谱技术的应用 存在的问题 需要全面发展色谱技术 大孔吸附树脂 离子交换色谱 天然产物色谱纯化理论滞后 研究方法替代生产工艺的模式 工艺技术单一 正相层析（硅胶和大孔树脂） 反相层析（C柱）、配合结晶技术 需要全面发展色谱技术 大孔吸附树脂 离子交换色谱 分子排阻色谱 亲和色谱 反相色谱 高速逆流色谱

分离纯化策略 涉及分离技术选择的因素 配合各种色谱技术是解决问题的最佳途径 提取的方法 提取物或混合物样品的复杂程度 样品的制备 样品的极性 样品的稳定性 样品的溶解度 样品量 分离技术的互补性 配合各种色谱技术是解决问题的最佳途径

分离纯化策略—— 亲水性化合物 大孔吸附树脂 离子交换色谱 亲水性分子排阻色谱 亲和色谱

分离纯化策略—— 亲水性化合物 大孔吸附树脂 快速、高效、成本低 适宜于单味药某类成分某极性段的单向提取 分离纯化策略—— 亲水性化合物 大孔吸附树脂 快速、高效、成本低 适宜于单味药某类成分某极性段的单向提取 不方便、不适于工艺放大：以聚苯乙烯为骨架，含有小分子致孔剂、交联剂等，在提取物中有较大残留。 吸附量下降至30％以上则不宜于再使用。 主要用于含生物碱、皂苷、蒽醌、水溶性酚性物质等中药单方或复方。

分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 典型的高选择性层析，分辨率高，载量大，工艺控制简单，规模容易放大 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 典型的高选择性层析，分辨率高，载量大，工艺控制简单，规模容易放大 具有显著的浓缩效果，能够从含量低的大量样品中捕捉目标 ，适合于初步纯化 再生能力强 阴离子交换 多糖、肽类、皂甙等具有生物活性物质，需要温和分离纯化条件 生物酸、生物碱等较强极性，对离子交换色谱选择性高的物质 阳离子交换

+ - 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 binding to cation exchanger net pka charge 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 R-NH2, pKa=8.0 pH<8.0, R-NH3+ pH>8.0, R-NH2 + binding to cation exchanger net pka charge 2 pH 10 binding to anion exchanger - R-COOH, pKa=5.0 pH<5.0, R-COOH pH>5.0, R-COO-

分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换树脂 有机酸 糖 糖醇 甙类 甾类、萜类及多环化合物 配糖体 小肽 氨基酸 核苷酸

分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 阳离子交换—— 阴离子交换—— UNOsphere S MacroPrep High S 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 阳离子交换—— UNOsphere S MacroPrep High S MacroPrep CM Uno S 可以直接从中药的稀酸浸提液中捕捉生物碱 从黄连中分离盐酸小檗碱 从苦参中分离苦参碱、槐定 碱和氧化苦参碱 从虫草中分离虫草素 阴离子交换—— 可以直接从中药的稀碱浸提液中捕捉生物酸、皂甙、内酯、多酚、醇类等 从葛根中分离葛根素 从三七中分离三七素 从柴胡中分离柴胡皂甙 以及甘草酸、阿魏酸、咖啡酸、阿魏酸等的分离 UNOsphere Q MacroPrep High Q MacroPrep DEAE Uno Q

分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 阳离子交换适合生物碱的纯化 粉防己碱 防己诺林碱

分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲水性分子排阻色谱 原理

分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲水性分子排阻色谱 按分子量大小分离 去除高分子量成分和聚合物 小分子较高分辨率分离 分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲水性分子排阻色谱 按分子量大小分离 去除高分子量成分和聚合物 小分子较高分辨率分离 快速分离中小分子有机酸、碱、皂甙、内酯、多酚、醇类等 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100 100 1,800 800 4,000 1,000 6,000 1,500 20,000 2,500 40,000 3,000 60,000 5,000 100,000

分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲和色谱——Affi-Gel硼胶 R OH 分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲和色谱——Affi-Gel硼胶 R OH 对具有邻/顺式羟基的化合物具有高亲和力，可高效分离糖类，核苷酸，核苷，儿茶酚胺等化合物 R 配基结构 A、分离环GMP和GMP B、分离各种核苷、碱基 亲和机理

分离纯化策略—— 亲脂性化合物 亲脂性分子排阻色谱 硅胶反相色谱 高速逆流色谱

分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 原理

分离纯化策略—— 亲脂性化合物 Bio-Beads S-X介质—— 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、杂环化合物 Bio-Beads S-X介质—— 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体 Bio-Beads S-X1 600 14,000 Bio-Beads S-X3 2,000 Bio-Beads S-X8 1,000 介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂 Bio-Beads S-X12 400

分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱——Bio-Beads S-X介质 Bio-Beads S-X8分离效果 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱——Bio-Beads S-X介质 Bio-Beads S-X8分离效果 1、三硬脂酸甘油酯，891 2、三肉豆蔻酸甘油酯，729 3、三月桂酸甘油酯，645 4、三辛酸甘油酯，477 5、三己酸甘油酯，393 6、十六烷，226 7、十一烷，156

分离纯化策略—— 亲脂性化合物 硅胶反相色谱 分辨率高，为分析首选 对样品要求较高 高反压，难装填，不适于放大 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 硅胶反相色谱 分辨率高，为分析首选 对样品要求较高 高反压，难装填，不适于放大 C4：Hi-Pore RP 304 C18：Hi-Pore RP 318

分离纯化新技术—— 高速逆流色谱（HSCCC） High Speed Countercurrent Chromatography 基于萃取原理的一种液液分配分离技术 使萃取过程在封闭的环境中进行 实现自动化过程 原理 高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。

分离纯化新技术—— 高速逆流色谱（HSCCC） HSCCC DuoFlow

分离纯化新技术—— 高速逆流色谱（HSCCC） 应用：更适合亲脂性物质，手性分子等 条件： 螺旋速度 溶剂体系的选择 成功的案例 已从数十种常用中草药中分离纯化出高纯度的活性成分单体上百种，其中包括 银杏黄酮苷元异鼠李素和山柰酚、何首乌二苯乙烯苷、葛根素、紫杉醇及其多种类似物、三七苷和三七素、淫羊藿苷、白藜芦醇和白藜芦醇苷、丹参酮、苦参、生物碱、羌活醇、大黄蒽醌类衍生物、沙棘黄酮、强抗氧化物番素、茶叶中的单体儿茶素EGCG、ECG、GCG等等。 HSCCC分离茶多酚粗品 1、3、4为未知组分，2为EGCG（表棓儿茶素棓酸酯）

分离纯化策略—— 过程设计 亲水性化合物 亲脂性化合物 离子交换色谱与分子排阻色谱结合 亲和色谱与分子排阻色谱结合 分离纯化策略—— 过程设计 亲水性化合物 离子交换色谱与分子排阻色谱结合 亲和色谱与分子排阻色谱结合 亲脂性化合物 分子排阻色谱与高速逆流色谱结合 高速逆流色谱与反相色谱结合

硬件平台—— 中草药与天然产物研究平台 Bio-Plex 有效成分 DuoFlow＋HSCCC 各成分分离 BioPlex+Cytokine 各成分筛选 有效成分 Bio-Plex

谢谢！