第七章 发酵染菌 及防治

所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养这一现象。 据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的青霉素发酵染菌率2％，链霉 素、红霉素和四环素发酵染菌率5％， 谷氨酸发酵噬菌体感染率1％～2％。 染菌对发酵生产率、提取率、得率、 产品质量和三废治理等都有很大的影响。

发酵异常现象 菌种在扩培阶段发生异常现象，必然会对发酵过程产生巨大的影响 异常现象是指发酵过程中某些理化参数和生物参数发生与原有特性不同的改变 包括种子培养异常和发酵异常

⒈ 种子培养异常 ⑴ 菌体生长缓慢 ⑵ 菌丝结团 ⑶ 代谢不正常 ⒉ 发酵异常 ⑴ 菌体生长差 ⑵ pH值过高或过低 ⑶ 溶氧水平异常 ⑷ 泡沫过多 ⑸ 菌体浓度过高或过低 谷氨酸发酵时正常和 异常的溶氧曲线

种子培养异常 菌体生长缓慢 菌种自身的原因 培养基的原因 操作过程的原因

种子培养异常 菌丝结团 通气溶氧不足、搅拌剪 切力过大、培养基质量 下降、种子冷冻保藏的 时间长、泡沫多、培 养液粘度低

种子培养异常 代谢不正常 表现出糖、氨基酸等的变化不正常，菌体浓度和代谢产物不正常。 原因 培养物和培养基不相匹配、培养环境差、接种量少、杂菌污染等

发酵异常 菌体生长差：由于种子质量问题或者是种子的保藏时间较长，导致活菌少或孢子萌发率低，延迟期长，发酵液内的菌体数量少。 种子质量差，发酵条件差，培养基质量差 均可引起糖、氧消耗慢甚至停滞。

发酵异常 pH异常 表现为pH突然升高或突 然降低，主要与培养基 原料差、灭菌不彻底， 加糖和加油过于集中。

发酵异常 溶解氧水平异常：发酵过程中，如果溶解氧水平发生了异常变化，一般都是发酵染菌的表现。 当受到好气性杂菌污染时，溶解氧的变化是短时间内下降，直至为零，且在较长时间内不能回升； 当受到非好气性杂菌污染时，抑制生产菌的生长，降低溶解氧的消耗，使溶氧升高。

发酵异常 菌体浓度过高或过低 泡沫过多

染菌隐患的检查 显微镜检查法 革兰氏染色法

染菌隐患的检查 肉汤培养法 检查培养基和无菌空气是否 带菌或菌种中是否有噬菌体。 一般使用葡萄糖酚红 肉汤作为培养基

染菌隐患的检查 平板划线培养或斜面培养检查法 以平板划线和肉汤培养结果为主要根据 要定期取样，取样时防止外界杂菌混入 倒平板 空培养 待测样品划线 培养观察

染菌隐患的检查 发酵过程的异常现象观察法 溶氧异常 排气中的CO2异常变化 1、在发酵过程中，发酵初期，菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧下降速度很快，并维持一定的水平，在这个阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧又再度上升。当感染噬菌体时，生产菌的呼吸受到抑制，溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶解氧的变化比菌体变化更灵敏，能更好地预见染菌的发生。2、排气中的CO2异常变化，浩气性发酵排出的CO2含量和糖代谢有关，对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出气体中的CO2的变化是有规律的。染菌后，糖耗加快，CO2含量增加，被噬菌体感染后，糖耗降低，CO2的含量随之降低。

发酵染菌原因分析 造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。 ㈠ 染菌的杂菌种类分析 四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽 孢杆菌和夹膜杆菌；柠檬酸的发酵最怕 青霉菌的污染；谷氨酸发酵最怕噬菌体 污染。 双球菌 梭状芽孢杆菌

㈡ 发酵染菌的规模分析 ① 大批量发酵罐染菌 ㈢ 不同污染时间分析 ② 部分发酵罐染菌 ③ 个别发酵罐连续染菌 ① 染菌发生在种子培养阶段， 或称种子培养基染菌 ② 在发酵过程的初始阶段发生染菌， 或称发酵前期染菌 ③ 发酵后期染菌

发酵染菌的原因分析 发酵工艺流程中的各环节漏洞 发酵过程管理不善

染菌原因的分析 国外一发酵工厂的染菌原因分析

染菌原因的分析 国内一发酵企业染菌的原因分析

杂菌污染后的挽救和处理 种子培养期染菌的处理 备用种子 无 重新制 备种子 物料管道 供气管道 彻底灭菌 有 种子罐染菌 发酵罐 ×

杂菌污染后的挽救和处理 发酵前期染菌的处理 培养基中碳、氮含量高 终止发酵，重新灭菌再接入种子进行发酵 放掉部分料液，加入新鲜料液，重新灭菌再接入种子进行发酵 培养基中碳、氮消耗量多 降温培养、调节ｐＨ、补加培养基进行处理

终适当加入杀菌剂或抗生素及正常的发酵液以抑制杂菌的生长速度。 产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐 杂菌污染后的挽救和处理 　　　轻微染菌 发酵中后期染菌的处理 终适当加入杀菌剂或抗生素及正常的发酵液以抑制杂菌的生长速度。 代谢产物已达一定水平 产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐 无提取价值的发酵液 加热至１２0℃，保 持30分钟后排放

杂菌污染后的挽救和处理 染菌后对设备的处理 发酵罐需要放罐后彻底清洗 空罐加热灭菌至120℃以上、保持30min后才能使用 甲醛熏蒸或溶液浸泡12h以上处理

杂菌的预防措施 强化空气净化过程 1．空气进化流程的选择 2．过滤介质的选择 3．过滤介质的填装 4．空气净化系统的管理

严格培养原料及设备的灭菌 原料的预处理 1．原料除杂：防止机械受磨损 2．粉碎：减少固体的团块 3．浸泡：使营养物质便于菌体的利用 4．糊化、液化和糖化：大分子物质分解为小分子物 质，易于菌体利用

严格培养原料及设备的灭菌 培养基的灭菌 在保证杀灭杂菌的前提下，尽可能多地保留营养物质。一般选择高温蒸汽对培养基、发酵罐及管路系统进行灭菌。 一般微生物的营养细胞在60℃维持10min就会 死亡。噬菌体一般在80℃下就会死亡

设备的灭菌 实罐灭菌时，要充分排尽发酵罐内的冷空气 对设备的死角要进行处理

法兰连接死角 发酵工厂的有关管路要保持光滑、畅通、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会

渣滓在罐底形成的死角 培养基在罐底形成的膜层，有一定的绝热作用，容易形成死角。

不锈钢衬里的死角 发酵液通过裂缝进入衬里 和钢板之间，窝藏在那里 形成死角。 采用复合钢板制造发酵罐 不产生死角。

接种管路的死角 种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。应该在1处焊接上一个排气阀。

排气管的死角 罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。 排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小 也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。 所以排气管不宜过大或过小。

不合理补料管配置造成的死角 不合理的补料管也容易造成死角

压力表安装不合理造成的死角 压力表安装不合理容易造成死角

定期检测发酵设备及管道 发酵设备的定期检查 1.搅拌系统转动有无异常 2.机械密封是否严密 3.罐内的螺丝是否松动 4.罐内的管道有无堵塞 5.罐体连接阀门是否严密 发酵罐气密性的检查方法是维持温度不变， 观察罐压是否恒定

管道、阀门的定期检查 管道容易因为各种原因发生渗漏导致染菌 管道与阀门及主体设备的连接处、变径连接处、与管件的连接处由于热胀冷缩、物料腐蚀等作用容易发生渗漏 检查方法：在管路系统中压入碱液，然后在 可疑的地方用浸渍酚酞的白布拭擦，如出现 红色，则为渗漏点。

阀门的渗漏 发酵设备中使用 最多的附属设备是 阀门，其中使用最 多的是截止阀。 阀心轧坏 填料的渗透

截止阀安装应注意方向问题 取样阀门是靠近发酵罐的第一阀门，为了在取样前对该阀门进行灭菌，阀门的安装和发酵液流向是相反的。该取样阀门的上密封结构的密封要求非常高。 打料、接种、加油、加糖等管道上的截止阀， 在发酵过程中还需要灭菌，阀门应按正向安装。

阀门试漏的方法 阀门试漏主要是通过水样法来测试

严格培养物的转移 无菌室 接种、移种等无菌操 作必须在无菌室内进行 要求：把无菌培养皿平 板打开盖子在无菌室内 放置30min，然后倒置 培养，长出的菌落应该 在3个以下为好。

灭菌锅 培养种子及小型实验用具的灭菌 操作时候要注意排气管是否畅通 要保持较长时间的排气

利用细菌或放线菌进行的发酵生产容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大威胁。 噬菌体污染及其防治 利用细菌或放线菌进行的发酵生产容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大威胁。 温和噬菌体（temperate phage）侵染菌体后由于具有溶源性，相对于烈性噬菌体（virulent phage）更加地隐蔽、危害更大。

预防噬菌体的危害 噬菌体直径约0.1微米，可以通过细菌过滤器，所以通用的空气过滤器不易将其除去。 引起原因： 设备的渗漏 空气系统、培养基 灭菌不彻底

环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。 防治噬菌体染菌的方法具体归纳以下几点： ① 严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”； ② 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌； ③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内； ④ 抑制罐内噬菌体的生长。

噬菌体的防治措施 定期检查噬菌体并采取有效措施 排气管要气封或引入药液（高锰酸钾、漂白粉或石灰水等溶液）槽中 检查生产系统，消除各种不安全因素 取样、洗罐或倒灌的带菌液体要处理后才 允许排入下水道 选育抗性菌株

应急挽救措施 加入化学物质 将培养液重新灭菌再接种（噬菌体不耐热，70－80℃经５分钟即可杀死）。 补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长 的生长因子，抑制噬菌体的生长。