荧光定量PCR 2011801188 刘 兵

目录 一、背景知识 二、荧光定量PCR概述 三、荧光定量PCR的主要原理 四、荧光定量PCR定量的理论依据 五、荧光定量PCR定量的理论模式

一、背景知识 1、1985 年，美国Perkin-Elmer Cetus 公司人类遗传研究室Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR），使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。 （陈旭等，2010）

2、1992 年，Higuchi最早提出了实时PCR 的设想，它的基本思想是利用荧光染料EB（溴化乙锭）可以插入到双链核酸中受激发光的性质，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，根据PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。（陈旭等，2010）

3、到1995 年，美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增产物定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作（整个过程中仅有加入样品的一次开盖），一举克服了常规PCR技术的诸多难题。 （陈旭等，2010）

二、荧光定量PCR概述 （1）在荧光定量PCR 反应中， 引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。从而得到一条荧光扩增曲线。（朱捷等，2009）

（2）、荧光扩增曲线包括3 个阶段：基线期，扩增期和平台期。只有在荧光信号扩增期，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以可以在这个阶段进行定量分析。（朱捷等，2009） （3）、为了便于对所检测样本进行比较，在荧光定量PCR 反应的指数期，需要设定一定荧光信号的阈值，一般这个阈值是以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本地信号， 荧光阈值的缺省设置是3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。 （朱捷等，2009）

（4）、如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号，它可以用于定义样本的阈值循环数（Cycle Threshold，Ct）。每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数存在线性关系。在PCR 过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到荧光阈值时，Ct 值被记录下来。（朱捷等，2009） 注：Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。在PCR循环过程中, 即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中, 这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻, 可见Ct值取决于阈值。（赵焕英等，2007）

（5）、起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct 值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 （朱捷等，2009）

三、荧光定量PCR的主要原理 荧光共振能量转移，外来的光源激发供体荧光染料发出荧光，当其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠，且两者的距离很近（约10~100埃）时，受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。

四、荧光定量PCR定量的理论依据 （1）、特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。 （2）、理想的扩增结果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体系中的原始模板数，n为扩增次数。

（3）、理论上PCR扩增效率为100%，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，实际应为： Y=X×(1+E)n，其中E代表扩增效率，通常E≤1通常X在1~105拷贝、循环次数n ≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数的增加，E值逐渐减少，Y呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。

五、荧光定量PCR定量的理论模 式 （1）、PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确的定量。

（2）、荧光定量PCR能相对准确的定量PCR， PCR扩增通式：① Tn=T0（1+E）n ② Tn=Tn-1（1+E） 注：[0＜E＜1] 其中E表示扩增速率，n为循环数，Tn表示在n个周期后PCR产物的量，Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的量，T0为原始模板数量。

CP=-1/lg（1+E）*lgT0+lgK/lg（1+E） （3）、设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光（荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，大约在1010左右）高于背景为仪器所识别，此时的循环数为CP（crossing point），也就是K=T0 （1+E）CP，取对数得： lgK=lgT0+CP*lg（1+E） CP=-1/lg（1+E）*lgT0+lgK/lg（1+E） 由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数CP对原始模板拷贝数的对数lgT0一次方程，其标准形式y=kx+b，该直线的斜率为 -1/lg（1+E），在横坐标上的截距为 lgK/lg（1+E），依据此作PCR标准曲线。

单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线

目前荧光定量PCR均采用外标定量 （1）、由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1 ，如从标准曲线中知道Slope=-3.337，则E=101/3.337-1=0.99，也有人将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之间，有时也有大于2的结果。

（2）、也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3，在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N2=N3，En2-n3=10，取对数得到 ⊿nlgE=1，E=101/⊿n，E=2，⊿n=3.32；E=1.8，⊿n=3.91。反之亦然。

荧光定量PCR使用外标定量的原因： A、内标对实时荧光定量PCR的影响 若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

B、荧光定量PCR无需内标定量 实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： （1）Ct值的高度重现性 PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

（2）Ct值与起始模板的线性关系 由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

六、 荧光定量PCR的分类 实时荧光定量PCR 包括探针类和染料类两种, 探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。染料类如SYBR Green I则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。

1、双链DNA(dsDNA)结合染料 （1）、Sybr Green I 检测模式 SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此， SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量有关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。

SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。 SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。

SYBR GREEN I 工作原理

（2）、LC Green TM I 与SYBRGreen I相比, 该染料是一种饱和结合染料, 能够完全结合dsDNA分子,可直接加入PCR反应体系中,高浓度的LC Green TM I不会抑制PCR反应。已有文献报道在PCR反应体系中加入LC Green TM I, 使用一对引物, 一个不作标记的探针, 结合常规融解曲线或仅使用一对引物, PCR 结束后通过分析融解曲线的形状和融解温度(Tm值)的大小, 对纯合子和杂合子以及寡核苷酸序列多态性(SNP)进行鉴别。LC Green TM I染料法简便、快速、精确性高, 预期将会有很好的应用前景。（赵焕英等，2007）

2、荧光标记探针 （1）、 水解探针模式（Taqman） TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5，末端，而淬灭剂则在3，末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3，端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5，外切酶活性将探针切断，使得荧光基因与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94℃ ～ 60 ℃ 40 个循环。常用的荧光基团是 FAM，TET，VIC，HEX。

Taqman探针工作原理

（2）、分子信标 分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对， 因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。PCR扩增程序通常是：94～55～72 ℃三步法，40个循环。

分子信标工作原理

（3）、 FRET探针 FRET探针又称双杂交探针， FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5，端标记FAM荧光基团，另一探针的3，端标记Red640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使 Red640 发出波长为640的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。

FRET工作原理

几种探针的比较：

七、传统的定量PCR的难点 （1）如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。 （2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增，而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、放射活性或者探针进行检测。

（3）大多数是终点检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（如下图所示），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量；虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以传统定量PCR的缺点是：劳动强度大、定量不准确、重复性差。

八、 荧光定量PCR的优点 （1）、特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。 （2）、灵敏度高，荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。 （3）、线性关系好、线性范围宽，由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0－1010拷贝/毫升。 （4）、操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。 （5）、速度快、高通量，可在2－3小时完成96个样品的定量分析。

九、怎样设计荧光定量PCR实验方案 1、基因序列的查找 2、引物、探针的设计 3、荧光定量PCR方法的确定 4、引物探针合成标记 5、标准品的制备 6、反应液的配制 7、反应条件的设定 8、基数的设定、数据分析

引物设计通常遵守如下原则： A、引物与模板的序列要紧密互补。 B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹 结构。 C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。 D、引物长度通常在20－25bp，Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。 E、引物的3’端避免使用碱基A；引物3’端避免出现3 个以上连续相同的碱基。 F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

探针设计通常遵守如下原则： A、探针位置尽可能地靠近上游引物。 B、探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物高5－10℃，GC含量在40%－70%。 C、探针的5’端应避免使用碱基G。 D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于 G的含量。

十、荧光定量PCR 技术在科研中的应用（朱捷等，2009） （1）DNA 或RNA 的定量检测应用 包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。实时荧光定量PCR 技术可以快速、准确定量测出

（2）、基因表达研究的检测应用 荧光定量PCR 技术对mRNA 水平的检测比Northern 杂交、RT-PCR 等定量方法要方便、快速、准确得多。荧光定量PCR技术可以对不同组织、不同处理之间（如药物处理、物理处理和化学处理等）、不同发育阶段基因表达差异进行检测，检测各基因在组织细胞中的表达丰度， 分析基因的表达调控、mRNA 的表达模式等研究。

（3）、食品安全中的检测应用 人们在日常生活中食品是否安全，进出口食品和粮食是否含有危险或潜在危险的成分，都可以用荧光定量PCR 技术进行快速检测,荧光定量PCR 方法是国内外进行转基因成分含量检测的常用方法。例如， 利用RQ -PCR 技术定量检测谷物基因来控制缺乏麦麸的婴儿食物。

（4）、医学及药物开发中的检测应用 荧光定量PCR 技术广泛的应用于临床及其药物方面，目前已经在肿瘤研究，乙肝诊断，病毒检测，动物疾病检测与防御，药物疗效的评价与考核等方面，为临床理论研究、治疗疾病和药物开发提供了客观的物质基础。

（5）、遗传学及SNPs 分析上的应用 荧光定量PCR 技术还可以用在点突变分析、等位基因分析、DNA 甲基化检测、单核苷酸多态性（SNP）分析及特异突变基因检测等。根据TaqMan 探针法在扩增之前处理DNA， 然后用特异的引物和探针可以区分甲基化和非甲基化的DNA。SNP 分析从根本上来说是确定一对染色体的每种基因的两个拷贝，结合荧光定量PCR 可以快速的检测SNP 结果。

谢谢！