菠萝蛋白酶活力钝化方法筛选及应用研究 学院：生命科学学院 专业：07级食品质量与安全 指导老师：朱秋劲老师 主讲人：宋珊珊
研究意义与目的 找到一种安全的菠萝蛋白酶活性钝化剂和其最佳钝化剂量，然后将其用于肉中菠萝蛋白酶活性的钝化。这样即利用了菠萝蛋白酶对肉的嫩化作用缩短传统发酵肉制品成熟的时间，增强了我国肉制品的市场竞争力，又能预防肉被过度嫩化带来的经济损失。
用于肉中菠萝蛋白酶活力的钝化 找寻相应钝化剂的最佳用量 主要内容 以菠萝蛋白酶液出发找寻最佳钝化剂
二、菠萝蛋白酶 钝化方法筛选 2.1 试验主要材料、试剂与设备 2.1.1 试验材料与试剂 2.1.2 主要试验设备： 材料：猪肉（购于花溪农贸市场） 试剂：菠萝蛋白酶（50万u/g广州众缘股份有限公司） 酪蛋白（Sigma ），甲醛溶液，NaOH，福林试剂，磷酸盐，三氯乙酸，碳酸钠。（其它试验工程中用过的试剂不用写吗？） 2.1.2 主要试验设备： FA2004N电子天平:上海民桥精密科学仪器有限公司 MT688多功能食物加工机:顺德市爱德实业有限公司 TGL20M台式高速冷冻离心机:长沙迈佳森仪器设备有限公司 DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅:天津市泰斯仪器有限公司 CLHN-350T恒温恒湿箱:天津市华北实验仪器有限公司 移液器:大龙医疗设备有限公司 pH计:上海佑科 磁力搅拌器:江苏金坛市恒丰仪器制造有限公司 UV-7502Pc紫外分光光度计:上海垒固仪器有限公司
2.2 菠萝蛋白酶钝化剂筛选 表2.1 筛选剂的添加浓度
2.2.1 测定方法：酶活力测定（福林法） 酶液制备 称取1g菠萝蛋白酶加水定容至100ml为菠萝蛋白酶母液，再吸取5ml母液用pH=7.5的缓冲液定容至50ml为试验酶液（相当于0.05g菠萝蛋白酶），现配现用。
钝化效果强弱：亚硝酸钠＞ EDTA-2Na＞硝酸钠＞乙醇。
所以确定硫酸锌为菠萝蛋白酶活力的最佳钝化剂。 钝化强弱：氯化锌＞硫酸锌＞醋酸锌＞葡萄糖酸锌>>亚硝酸钠
三、 确定最佳钝化剂量 试验剂量组为0.02g，0.05g，0.08g。结果如图所示，在试验剂量组下硫酸锌对菠萝蛋白酶活力钝化作用效果显著（p ＜ 0.01）。但随着硫酸锌用量的增加，各浓度之间的钝化效果无显著性差异。所以在0.02g的基础上再次降低硫酸锌用量找寻最佳钝化剂量。
所以1g菠萝蛋白酶中加0.4g硫酸锌其钝化效果最佳。 试验结果如图所示 可确定硫酸锌用量为0.02g时，钝化效果和用量最佳。 所以1g菠萝蛋白酶中加0.4g硫酸锌其钝化效果最佳。
四、肉中钝化效果测定 4.1 感官观察 分别取100g为一袋的肉样6袋，10℃，20℃， 30℃为试验温度，每个温度下两组样品，分别加入0.02g菠萝蛋白酶（前期项目试验确定100肉加0.02g菠萝蛋白酶嫩滑效果最好。用1ml蒸馏水溶解加入，再用1ml蒸馏水润洗加入），反应1h（前期项目试验确定了菠萝蛋白酶与肉反应1h嫩化效果最好），试验组加0.008g硫酸锌 （先用1ml蒸馏水将其溶解，再用1ml蒸馏水润洗加入试验组肉糜中），空白组加2ml蒸馏水于肉糜中。将肉样放入不同温度下反应3天观察其结果。
所以前期试验确定的1g菠萝蛋白酶中加0.4g硫酸锌能很好的钝化肉中菠萝蛋白酶的活力
4.2 硫酸锌对嫩化猪肉糜氨基酸态氮含量的影响 4.2.1 试验方法 4.2.2 测定方法：氨基酸态氮测定（电位滴定法） 反应1h肉样中氨基酸态氮含量 反应中 反应12h肉样中氨基酸态氮含量 100g肉+0.02g菠萝蛋白酶反应1h 取5g肉样定容至100ml测其氨基酸态氮含量 试验组加入0.008g硫酸锌，空白组加2ml蒸馏水于肉糜中。 反应12h 取5g肉样定容至100ml测其氨基酸态氮含量 4.2.2 测定方法：氨基酸态氮测定（电位滴定法）
4.2.3 钝化效果指标—氨基酸态氮的测定 可见前期试验确定的钝化剂量对肉中菠萝蛋白酶活力的钝化是可行而且效果显著的。 图4.1 硫酸锌对肉中氨基酸态氮含量的影响
4.3 钝化剂对嫩化猪肉糜中菠萝蛋白酶活力的影响 4.3.1 试验方法 分别在10℃，20℃，30℃下制备肉样酶液用福林法测其酶活力；改变磷酸缓冲液的pH，分别在pH=5.8，pH=6.2，pH=6.6的条件下制取肉样酶液用福林法测其酶活力；在钝化过程中以10min为时间间隔制取肉样酶液用。 4.3.2 测定方法------福林法 （1）肉样酶液制备：100g肉样中加0.2g菠萝蛋白酶反应5min，加入钝化剂（空白组加2ml蒸馏水），反应10min，分别取5g肉样，加2ml pH=7.5的磷酸缓冲液用研钵研细，在用2ml pH=7.5的磷酸缓冲液润洗研钵一起加入离心管，在转速为9000转/min，4℃下离心20min。上清液即为试验所需肉样酶液。
温度、时间，pH的变化不会影响硫酸锌对菠萝蛋白酶活力的钝化作用
5. 总结 从上述可知，硫酸锌为菠萝蛋白酶活力的最佳钝化剂。1g菠萝蛋白酶：0.4g硫酸锌的用量为最佳钝化剂量；同时硫酸锌对菠萝蛋白酶活力的钝化作用不会随温度、时间、pH的改变而消失，这种钝化作用会一直存在。
感谢薛力荔师姐和食科系各位师兄姐的帮助！ 致 谢： 感谢朱老师的悉心指导！ 感谢薛力荔师姐和食科系各位师兄姐的帮助！ 感谢各位老师四年的教导！
Thanks！