海藻多糖降解酶的研究 胡 忠 2009-10-26

主要内容 一、海藻多糖 二、海藻多糖降解酶 三、本课题组的相关研究

一、海藻多糖 1、来源 海 带 龙须菜 紫 菜 裙带菜

海藻胶是海藻细胞壁内的主要填充物质，约占细胞干重的20%－30%。 8000多种海藻：蓝藻、绿藻、红藻和褐藻。 海藻胶是海藻细胞壁内的主要填充物质，约占细胞干重的20%－30%。 琼胶 卡拉胶 褐藻胶 世界产量 (万吨) 1 - 2 约 3 3 - 4 中国产量 0.3-0.4 1.2 约 2

近年来，各国的科学家大力开展从海洋开发新药物的研究计划。因此，对海藻、海藻多糖及其多糖类代谢产物进行了大规模的化学分离、结构确定及生物活性筛选研究。 至今，已经从海藻中分离到了具有抗菌、抗肿瘤等活性的多糖类代谢产物，海藻寡糖的生理作用也不断被揭示，引起了人们更大的兴趣。

2 、特性 一类多组分混合物，由不同的单糖基通过糖苷键相连而成，是海藻细胞间和细胞内所含的各种高分子碳水化合物的总称。 一般为水溶性，大多含有硫酸基，多具高黏度或凝固能力 种类很多，根据其来源不同，分为红藻多糖、绿藻多糖、褐藻多糖等，其中褐藻多糖的种类和数量最多。

三大海藻多糖： 褐藻胶：来自海带、羊栖菜等褐藻。 琼胶(agar)、卡拉胶(carrageenan)、褐藻胶(algin) 褐藻胶：来自海带、羊栖菜等褐藻。 卡拉胶：角叉菜、杉藻、江篱等红藻；有13 种类型，主要有κ-卡拉胶、-卡拉胶、ι-卡拉胶等。 琼胶：江篱、石花菜等红藻，由琼胶糖和硫琼胶两部分组成。

3、海藻多糖的化学结构 3.1 褐藻胶 褐藻胶是由多聚D-甘露糖醛酸(M)n和多聚L-古罗糖醛酸(G)n以不同规则的排列顺序分布于分子链中，两者中间以交替的MG或多聚交替(MG)n相连接

3.2 琼胶 琼脂糖(Agarose)和硫琼胶(Agaropectin)的混合物。 3.2 琼胶 琼脂糖(Agarose)和硫琼胶(Agaropectin)的混合物。 琼脂糖是以(1,3)-β-D-半乳糖基-(1,4)-3,6-内醚(或不内 醚化)-α-L-半乳糖为重复二糖的多糖。 硫琼胶，又称硫酸脂琼胶、琼脂果胶，是带有硫酸脂（盐）、葡萄糖醛酸和丙酮酸的复杂多糖。 琼脂糖结构

3.3 卡拉胶 卡拉胶以(1,3)-β-D-半乳糖基-(1,4)-3,6-内醚(或不内醚化)-α-D-半乳糖为重复二糖的多糖。 3.3 卡拉胶 根据硫酸根数量和位置分为不同类型

卡拉胶和琼胶均来自于红藻，结构非常相似 琼脂糖和卡拉胶 的二糖组成比较 琼胶中的琼脂糖不含有硫酸根，不带电， 应用于核酸电泳；琼胶中的硫琼胶含有硫酸根 如何去除硫琼胶是琼脂糖制备中的关键。 总体上：卡拉胶中的硫酸基明显多于琼胶

4、海藻多糖的应用 4.1 琼胶 琼胶可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保鲜剂、粘合剂和生物培养基。 agar plate 4.1 琼胶 琼胶可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保鲜剂、粘合剂和生物培养基。 agar plate 核酸电泳 琼脂糖 agarose

4.2 卡拉胶 具有形成亲水胶体，凝胶、增稠、乳化、威膜、稳定分散等特性，因而被广泛应用于乳制品、冰淇淋、果汁饮料、面包、水凝胶（水果冻）、肉食品、调味品、罐头食品等方面。 4.3 褐藻胶 广泛应用于食品、医药、纺织、印染、造纸、日用化工等产品，作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、粘合剂、上浆剂等使用。

5、海藻低聚糖 5.1 褐藻胶低聚糖 褐藻胶被广泛应用于各种工业生产中，褐藻胶或其分级产物经特定的方式改性后，有特殊的生理活性，如： 5.1 褐藻胶低聚糖 褐藻胶被广泛应用于各种工业生产中，褐藻胶或其分级产物经特定的方式改性后，有特殊的生理活性，如： 治疗缺血性心脑血管疾病的海洋新药－－藻酸双酯钠(PSS)，已创产值近20亿元，产生了巨大的社会效益和经济效益，治疗缺血性心脑血管疾病的甘糖酯等。 （管华诗）

5.2 琼胶低聚糖 5.3 卡拉胶低聚糖 在药物方面的应用：抑制癌细胞的发生、抗病毒等。 5.2 琼胶低聚糖 作为淀粉老化抑制剂、高甜度甜味剂的充填剂及分散剂、抗氧化剂；功能性食品基料等食品添加剂 ； 在药物方面的应用：抑制癌细胞的发生、抗病毒等。 天然防腐剂 皮肤保湿、增白 益生元 5.3 卡拉胶低聚糖 抗肿瘤；对放射性损伤的保护作用；抑制血管生长；抗氧化；抗菌 等

如何制备海藻低聚糖 ？

两种方法： 酸法：降解海藻多糖反应剧烈、工艺条件难以控制，酸解法制备低聚褐藻胶已不能适应市场的需要。 酶法：降解具有高效性和专一性的特点，而且降解条件温和，水解产物不易被破坏，利于产物分析和回收，因而逐渐代替了传统的酸解法。

二、海藻多糖降解酶 1、分类 褐藻胶裂合酶、卡拉胶酶、琼胶酶 2、来源 海洋中的一些软体动物 鲍、海胆、螺等

微生物来源 相关细菌可来自：海洋植物体表、动物肠道、海水及海洋沉积物 卡拉胶酶：海洋细菌噬纤维菌属、假单胞菌属等 褐藻胶裂合酶：固氮菌属和假单胞菌属等海洋细菌以及真菌 等 琼胶酶：噬纤维菌属、假单胞菌属、链霉菌属、弧菌属、别单胞菌属等

3.1 褐藻胶裂合酶 (alginatelyase) 3、海藻多糖降解酶的作用机制 3.1 褐藻胶裂合酶 (alginatelyase) 专一作用于多聚D2甘露糖醛酸(M)n的甘露糖醛酸酶； 专一作用于多聚L2古罗糖醛酸(G)n的古罗糖醛酸酶(占多数)； 某些海洋细菌甚至可以同时产生具有降解多聚D2甘露糖醛酸(M)n和多聚L2古罗糖醛酸(G)n的酶系。 1998 年，Ertesvag等人从维涅兰德固氮菌 ( Azotobacter vinelandii) 中得到一种褐藻胶酶，该酶可以降解MM 和 MG 键的多糖， 但不能降解 GM 和 GG 键。

褐藻胶裂合酶的作用机制 褐藻胶裂合酶催化β-消去反应，断裂褐藻胶分子链，在新的非还原端产生具有不饱和双键的糖醛酸，此单元在230~240nm有强烈的紫外吸收。因此，酶活力的测定可在此范围内的波长内测定。 poly(G) poly(G) GG poly(M) MM MG

Sphingomonas sp. A1的褐藻胶裂合酶A1-II′与底物作用的结构模型 与三糖 GGG 的绑定 与三糖 MMG 的绑定 Ogura et al.2008, J. Mol. Biol. 380, 373–385

催化部位氨基酸残基与三糖 GGG 之间的 作用，蓝色代表G单元，绿色代表与 底物有氢键作用(黑色虚线)的氨基酸残基。 催化部位氨基酸残基与三糖 MMG 之间的 作用，蓝色代表G单元，红色代表M单元

3.2 卡拉胶酶(carrageenase) 根据卡拉胶酶的底物专一性不同可将卡拉胶酶分为：-卡拉胶酶、-卡拉胶酶和-卡拉胶酶

ι-卡拉胶酶裂解部位 ι-卡拉胶酶 的晶体结构 Michel G. et al.2001, J Biol Chem. 276(43):40202-9

催化部位的关键氨基酸 ι -卡拉胶酶的催化部位 及其与底物结合示意图

3.3 琼胶酶 (agarase) -琼胶酶 琼脂糖

α－琼胶酶 β－琼胶酶 琼寡糖agarooligosaccharides 新琼寡糖neoagarooligosaccharides α-琼胶酶 β-琼胶酶 Reported agarases

Pseudoalteromonas atlantica 菌的β －琼胶酶酶系

琼胶酶降解琼胶机制 Allouch 在研究Zobellia galactanivorans Dsij所分泌的β-琼胶酶降解琼胶糖的琼胶酶-琼胶寡糖复合物晶体结构时发现，在琼胶酶蛋白质体上结合了两条寡糖链，一条在其催化活性部位处，蛋白体结合了寡糖链上四个糖单体，另一条接合在与催化活性部位相对应平行的部位上，蛋白体上结合另一条寡糖链上的8个糖单体；由此推断，这种含有两个平行的糖链接合位点的琼胶酶意味着该酶可能在催化降解琼胶糖之前能解开琼胶糖的双螺旋结构。

4、海藻多糖降解酶的生化性质

5、海藻多糖降解酶的应用 （1）制备海藻低聚糖，为新药、新功能食品的开发提供新的手段 （2）作为海藻遗传工程酶 （3）研究海藻多糖结构 如：制备原生质体 （3）研究海藻多糖结构 （4）其他应用 如：琼胶酶可用于DNA胶回收

6、海藻多糖降解酶的研究概况 20世纪90年代前：少数的研究，少量酶得到纯化 90年代后：许多酶得到纯化，广泛应用分子生物学技术构建基因工程菌 近几年 ：更注重研究酶的空间结构、酶降解海藻多糖的机理，以期提供在分子水平上改造酶的可能性。目前有关海藻多糖降解酶三维结构的报道还比较少。

海藻多糖降解酶的基因克隆及结构研究代表了这一领域最新、最重要的进展。通过将海藻多糖降解酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细胞，可使海藻多糖降解酶的发酵产率发生量的飞跃。 此外，对海藻多糖降解酶结构的详细了解使得设计适合工业化应用的酶种成为可能。

欧美最早开展海藻多糖降解酶研究，进入20世纪90年代日本广泛开展这方面研究， 到目前为止，日本在国际上发表的相关论文最多，法国其次。 中国在近几年才开始注重海藻多糖水解酶的研究，目前在国际上发表的相关论文还较少。

三、本课题组的相关研究 1、产琼胶酶菌株 目前已经筛选得到多株产琼胶酶以及褐藻胶裂解酶的海洋细菌，其中有五株细菌高产琼胶酶，分别命名为HZ105、ZC1 、X3 、LA1、LA2。

HZ105 Agarivorans sp.HZ105 碘液活性染色 2216E平板

ZC1 2216E平板 碘液染色

X3 2216E平板 碘液染色

Vibrio sp.LA1 Agarivorans sp.LA2 以琼胶为唯一碳源

菌株ZC1 的16S rRNA 基因， 相似性最高的 只有95.5％ Bar, 0.02 substitutions per nucleotide position.

菌株形态 生理生化 脂肪酸组成 碳源利用 G＋C mol％ 菌株鉴定 16S rRNA 基因序列分析 代谢类型 醌类物质 菌落形态

2、琼胶酶的分离纯化 菌株HZ105琼胶酶的分离、纯化 将菌株HZ105 胞外粗酶液进行PAGE电泳凝胶后的卢哥氏碘液活性染色表明HZ105产生三种胞外琼胶酶，分别为琼胶酶a、b、c。 1：胞外粗酶液的碘液活性染色 2：胞外粗酶液的PAGE

纯化后琼胶酶的SDS-PAGE 将PAGE电泳凝胶中的琼胶酶条带回收，SDS-PAGE表明琼胶酶a,b,c 的分子量分别为105kDa、58kDa、54kDa。 b c 1－2 ：琼胶酶b（1）、c（2）的活性染色 3－4： 琼胶酶b（3）、c（4）的非变性电泳 5－6 ：琼胶酶b（5）、c（6）的变性电泳 M：蛋白标准

琼胶酶b 、c的质谱(LC MS/MS)鉴定结果： 琼胶酶b与来自菌株Vibrio sp. JT0107的一个 β-琼胶酶最为匹配

琼胶酶c与来自菌株 Agarivorans sp. JAMB-A11的一个 β-琼胶酶最为匹配

3、琼胶酶基因的研究 方案1：采取随机切割产琼胶酶细菌总DNA的策略，回收1-10kb的DNA片段与酶切的质粒载体连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。 重组子的筛选策略 方案2：比较已报道的琼胶酶基因已得到保守区域，并以此设计引物通过合适的PCR得到琼胶酶基因。

3.1 部分基因组文库克隆琼胶酶基因 菌株X3 菌株X3所产琼胶酶的最适反应温度较高 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 3.1 部分基因组文库克隆琼胶酶基因 菌株X3 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 47 52 57 62 67 72 反应温度（℃） 酶活力（U/mL） 菌株X3所产琼胶酶的最适反应温度较高

筛 选 部分基因组文库 线路图： 菌株基因组 DNA 3000bp 转化 BamHI 酶切 同尾酶 Sau3AI 酶切 目的片断 筛 选 3000bp 部分基因组文库 转化 p-Bluescript SK BamHI 酶切 同尾酶 菌株基因组 DNA Sau3AI 酶切 目的片断

插入片段1：1260bp，其中含有一个612bp的ORF，推测其编码琼胶酶 ■ 部分基因组文库克隆菌株X3的琼胶酶基因 大约20000个阳性克隆子，出现20个左右的凹陷的琼胶水解圈；阳性克隆子经验证，分别有2种插入片段： 插入片段1：1260bp，其中含有一个612bp的ORF，推测其编码琼胶酶

插入片段2：3656bp，其中含有一个长1590bp的ORF，Blastp比对，推测是琼胶酶。

1590bp ORF的Blastp比对结果

1590bp 的ORF与pET-32a构建重组表达载体，转化大肠杆菌，重组菌表现琼胶酶活性 重组菌DH5α-X3a染色前 用卢戈氏碘液染色后的重组菌DH5α-X3a

3.2 利用序列同源性克隆基因 根据已报道的琼胶酶基因序列的同源性or保守区域，设计引物通过PCR得到琼胶酶基因。 3.2 利用序列同源性克隆基因 根据已报道的琼胶酶基因序列的同源性or保守区域，设计引物通过PCR得到琼胶酶基因。 Agarivorans sp. HZ105

Agarivorans sp.HZ105 是否也具有类似的琼胶酶基因？ 以下菌株的琼胶酶基因序列存在较大相似性 Agarivorans sp. JA-1, Agarivorans sp. JAMB-A11， Agarivorans sp.QM38, Vibrio sp.PO-303, Vibrio sp. JT0107 Agarivorans sp.HZ105 是否也具有类似的琼胶酶基因？ 根据所报道的上述菌株的琼胶酶基因序列设计引物 Agarivorans sp.HZ105 4个琼胶酶基因 HZ1, HZ2, HZ3, HZ4

HZ1 琼胶酶基因HZ1 Blastn 2988bp Highest identify：98% 琼胶酶基因HZ1 氨基酸序列 Blastp

NCBI conserved domain database （CDD） 没有搜索到保守区序列 琼胶酶基因HZ1 氨基酸序列 NCBI conserved domain database （CDD） 没有搜索到保守区序列 InterProScan数据库搜索：蛋白质结构域和功能位点 表明该序列编码的琼胶酶的功能结构域与以往报道的琼胶酶有所不同，可能存在着新的结构功能特性。

琼胶酶基因HZ1 在大肠杆菌的重组表达 pET-32a LB琼脂平板 碘液染色

HZ2 Blastn result of agarase gene HZ2 (2868bp)

Blastp result of agarase HZ2 糖基转运和代谢

HZ3 Blastn result of agarase gene HZ3 1437bp Blastp result of agarase HZ3 No putative conserved domains have been detected

琼胶酶基因HZ3 在大肠杆菌的重组表达 pET-32a LB琼脂平板 碘液染色

HZ4 Blastn result of agarase gene HZ4 1362bp Blastp result of agarase HZ4

糖水解酶16家族-琼胶酶亚家族的催化区 agarase HZ4 的保守区 Putative conserved domains have been detected 糖基绑定 糖水解酶16家族-琼胶酶亚家族的催化区 Ricin-type beta-trefoil; Carbohydrate-binding domain ？重组表达，验证糖基绑定作用

琼胶酶基因HZ4 在大肠杆菌的重组表达 pET-32a LB琼脂平板 碘液染色

各个琼胶酶及其可能的降解琼脂糖的产物： HZ3：菌株 HZ105 agaD03：A.QM38 agaC：V.PO-303 8、10、12、14糖 agaB：P.CY24 菌株HZ105的琼胶酶HZ3 和HZ4可能主要被分泌到胞 外，主要负责将琼脂糖降解 为高聚合度的琼胶寡糖。 HZ4：菌株HZ105 agaA：P.CY24 主要产物 8、10糖 agaD：V.PO-303 有糖基绑定模块 可能攻击固态琼胶 HZ1：菌株HZ105 agaD01：A.QM38 agaE11：A.JA-1 agaA11：A.JAMB-A11 产生2、4、6糖，最终2糖 agaA：V.JT0107 产生2、4糖 agaB：V.PO-303 菌株HZ105的琼胶酶 HZ1和HZ2可能锚定 在膜上，主要负责将 高聚合度的琼胶寡糖 降解为二糖。 HZ2：菌株HZ105 agaD02：A.QM38 agaB：V.JT0107 2糖 agaE：V.PO-303

HZ1 和 HZ2 在染色体上的位置 74bp HZ2 2868bp HZ1 2988bp 染色体

根据氨基酸保守序列设计简并引物 CODEHOP :简并引物设计 http://blocks.fhcrc.org/codehop.html 部分琼胶酶 的保守氨基酸 Forward Primer ：5’-GATCCATGGTGTATTGGTGTTTTTryngayaayga -3' Reverse Primer ：3’-gtraccaargtTATATAACTAGTTGGTTAATGACCAG -5' 引物简并部位 Y (CT) ；N (AGCT) ；R (AG) ； B (CGT) ；H (ACT) ；……

简并引物对菌株总DNA的PCR扩增 1: Agarivorans sp.HZ105 M 1 2 3 4 2: Vibrio sp.LA1 3: Agarivorans sp.LA2 4: Strain ZC1 M: DNA Marker 测序 约700bp Agarivorans sp.HZ105 : HZ2基因 引物 Blast GATCCATGGTGTATTGGTGTTTTTryngayaayga -3' gtraccaargtTATATAACTAGTTGGTTAATGACCAG -5'

? 如何获取完整的基因 M 1 2 3 4 4: Strain ZC1 测序 翻译 Blastp 687bp 229 aa 琼胶酶 相似性 : 20-51% ? 如何获取完整的基因

如何获取已知序列的侧翼序列

目前正在（将）开展的工作： 实现琼胶酶基因的高效表达，以获取高效的重组琼胶酶 寻找琼胶酶基因的催化活性部位 制备琼胶寡糖，并研究其生理功能活性 获取琼胶酶的晶体结构，解析结构与功能的关系

Thank You!