第一章 工具酶

主要内容 一．限制性核酸内切酶 二．其它工具酶 1． DNA连接酶 2．聚合酶 3．DNA修饰酶 4. 细胞裂解酶

一．限制性核酸内切酶 1.限制性核酸内切酶的定义与特点 2.限制性核酸内切酶的发现 3. 限制和修饰作用的分子机制 4.限制性内切酶的分类 5.限制性内切酶的命名 6. II型限制性核酸内切酶的基本识别特性 7.限制性内切酶的切割方式 8. II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 9.影响限制性核酸内切酶活性的因素及解决方法 10.限制性内切酶的star活性 11.其他特异性的限制酶 12.DNA分子的片段化

定义： 一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核苷酸酶。

特点： ▲ 存在于任何一种原核细菌中. ▲ 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产 生相应限制性片段. ▲ 各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图 谱. ▲ 在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑 事侦察领域极为重要.

限制性内切酶的发现： 宿主细胞的限制和修饰作用 1. 两种不同来源的 λ-噬菌体, λK；λB . 2. 能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（λK→K株, λB →B 株） 3. 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。 4. 一但λK 噬菌体在B 株成功，由B 株繁殖出 λK 后代，能感染B 株, λK →B 株.不能感染原来 K株. λK × K株

限制和修饰作用的分子机制 2. λ噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株 中. 3．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外DNA。 4. C 株 不能产生限制性内切酶，其它来源λ- 噬菌体可以感 染C 株，而在 C 株繁殖 λ- 噬菌体则在 K株和B 株,受到严格的限制作用。

问题 1. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当。 A。由作用于同一DNA序列的两种酶构成 B. 这一系统中的核酸酶都是II类限制性内切酶 C. 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 D. 不同的宿主系统具有不同的限制－修饰系统 2.判断下面一句话是否正确 限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。

1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）hsdR 编码限制性核酸内切酶---识别DNA 分子特定位 点，将双链DNA 切断。 （注意：DNA分子转化细胞：受体细胞去掉 hsdR 基因位点） 3）hsdM 编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA 分子特定位点的碱基甲基化反应。 4） hsdS 表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。

限制和修饰作用的分子机制 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA 和噬菌体DNA特异性保护,封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（修饰）

限制和修饰作用的分子机制 3) 由于降解不完全，外来少数DNA 分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 4) 外来少数DNA 分子,虽然是外来却不被降解。但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记, 一但 λ-K 噬菌体在 B 株成功，由B 株繁殖出 λ-K 后代 能感染B 株, 不能感染原来K株.

限制性内切酶的分类：（三大类） I． I 类，II 类, III 类. 2． I 类，III 类为限制---修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在 同一酶分子中。 3 ．II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的， 切割位点专 一，适合于DNA重组。

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的分类 主要类型 I型 II型 III型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2＋SAM Mg2＋ ATP Mg2＋ SAM 识别序列 无规律，如EcoK： 旋转对称 无规律，如EcoP15： AACN6GTGC CAGCAG 切割位点 距识别序列1kb 识别序列内或附近 距识别序列下游 处随机性切割 特异性切割 24－26bp处

问题： 1.下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（） A.限制酶是外切酶而不是内切酶 B.限制酶在特异序列（识别位点）对DNA进行切割 C.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同 D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末端 E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端 2.II类限制性内切酶（） A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 B.仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列 D.有外切核酸酶和甲基化酶活性 E.仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供

限制性核酸内切酶的命名 株名 序数 来源菌株 EcoR I E co R I E.coli R株 Hind III H in d III 名称 属名（大写、斜体） 种名（小写、斜体） 株名 序数 来源菌株 EcoR I E co R I E.coli R株 Hind III H in d III Haemophilus influenzae d株 Hind II II Hpa I pa － Haemophilus parainfluenzae

问题： 下列关于限制性内切酶的表示方法中，正确的一项是（） Sau 3A I B. E. co R I C. hind III D. Sau 3A I

II型限制性核酸内切酶的基本识别特性 1）大多数酶的识别顺序是严格的，少数有变动。如Hind II的识别位点是GTPyPuAC.其中Py代表C或T，而Pu代表A或G。 2）识别顺序的碱基数一般为4～6个碱基对，一般富含GC

II型限制性核酸内切酶的基本识别特性 3）大多数识别位点具有180℃旋转对称，少数酶的切割位点在识别位点外，具有旋转对称性。 如 EcoR I 的切割位点 EcoR I 的识别位点 5‘…GCTGAATTCGAG…3’ 3’…CGACTTAAGCTC…5’ 4）II型酶的识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用 5) 同一种DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。1/4n

问题： 1.在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？ 2.下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类酶的识别序列：GAATCG 、AAATTT、 GATATC、ACGGCA？ 为什么？ 3. 如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4个碱基序列的限制性内切酶大概隔（）碱基对可进行一次切割 A. 125 B. 256 C. 425 D. 625 E. 1056 4. 如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4碱基序列的限制内切酶大约可将1Mb的DNA切割成多少段？（） A.125 B.320 C.625 D.1050 E.1600

限制性内切酶的切割方式 切割位点，用 或 表示。 A．以切出片段末端性质不同 平末端 5 ’突出的黏性末端 3’突出的黏性末端

限制性内切酶的切割方式 B．以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。

限制性核酸内切酶的切割方式 5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …3’ EcoR I等产生的5‘粘性末端 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …5’ 5‘…G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …5’ OH P 5‘…G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C …5’ P OH Eco RI 37 ℃ 退火4-7 ℃

限制性核酸内切酶的切割方式 Pst I等产生的3‘粘性末端 5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …5’ Pst I 37 ℃ 退火4-7 ℃ OHP 5‘…G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …5’ POH 5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …5’

限制性核酸内切酶的切割方式 Pvu II等产生的平头末端 5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …5’ Pvu II 37 ℃ 5‘…G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …3’ 3‘…C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C …5’

限制性核酸内切酶的切割方式 内切酶的识别位点与切割方式之间的关系 1）识别序列不同，切割方式不同 如：EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTCGAG-3’ 3’-GAGCTC-5’ 2) 识别顺序不同，切割产生的黏性末端相同——同尾酶 如：BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Bgl II 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’

限制性核酸内切酶的切割方式 内切酶的识别位点与切割方式之间的关系 3)识别序列相同，但切割方式不同——同位酶 如：Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ Xma I 5’-CCCGGG-3’ 4)相同的识别序列，切割方式也相同——同裂酶 如：Hpa II 5’-CCGG-3’ 3’-GGCC-5’ Msp I 5’-CCGG-3’ 但Msp I可以切甲基化的胞嘧啶

1. BamH I、Xba I、Bgl II的识别位点分别是：GGATCC、 TCTAGA、AGATCT，哪些酶切结果可产生互补的末端？（） 问题 1. BamH I、Xba I、Bgl II的识别位点分别是：GGATCC、 TCTAGA、AGATCT，哪些酶切结果可产生互补的末端？（） A.以上几种酶切结果产生的末端都可互补 B. 产生的末端都不能互补 C. 仅Bam H I和Bgl II的酶切末端互补 D. 仅Bam H I和Xba I的酶切末端互补 E. 仅Xba I和Bgl II的酶切末端互补 2. . Bst B I(TT CGAA）消化可产生怎样的末端（） A.含5’CGAA 3’序列的黏性末端 B.含5’CG 3’序列的黏性末端 C. 含5’AAGC 3’序列的黏性末端 D. 平末端 E. 含5’GC 3’序列的黏性末端

II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件： 待酶切的DNA样品 内切酶 反应缓冲液 温度37℃，1－2hr完成酶切，所需酶量由切割的DNA量决定 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解1 μg 标准DNA所需的酶量

影响限制性核酸内切酶活性的因素 1）底物DNA 2）内切酶的用量 3）反应缓冲液(浓度（10×）mmol/L) 4）反应温度

底物DNA ① DNA纯度 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等 ② DNA分子构型 ③ 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含有识别序列的寡核苷酸没有催化活性，其序列两端各延长一个或几个核苷酸后才能被有效切割。 ④ 位点偏爱 侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关系。如pBR322 DNA上的4个Nae I的识别位点切割效率不同。

底物DNA ⑤ DNA甲基化 dcm和dam甲基化酶 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但Bam H I、Bgl II、Sau 3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有Eco R II等 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基

解决方法： 对DNA进行有针对性的纯化； 加大酶的用量，1 μg DNA 用10U 酶； 加大反应总体积； 延长反应时间；

2）内切酶的用量 反应体系中内切酶的用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 当底物确定后，酶的用量视酶活性而定。酶活性高的用量少，反之则高。

容积活性（volume activity）：1ul酶液中具有的酶活性单位，即U/ul。 等量的两种DNA样品，由于含同种限制性核酸内切酶识别序列的密度不同，则酶量也不同。密度大的用酶多。

3）反应缓冲液(浓度（10×）mmol/L) 缓冲液成分 A B C D E Tris-Ac 330 Tris-HCl 100 500 100 100 Mg-Ac 100 MgCl2 50 100 100 100 K-Ac 650 NaCl 1000 1000 500 DTT 5 10 10 10 β-巯基乙醇 10 pH值（37℃） 7.9 8.0 7.5 7.5 7.5

4）反应温度 大多数内切酶的最适温度为37℃，少数高于或低于37℃.各种酶的最适温度见各产品说明书。

限制性内切酶的star活性 定义：某些限制性内切酶在特定条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等），可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为star活性。 如：Eco R I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’ 另，不同的酶产生star活性的条件不同，见书p73.

问题 1.从细菌中分离基因组DNA，经过识别GAATTC序列的6碱基酶长时间消化后，发现DNA分子未被切动，基因组大小为4Mb，造成该结果的原因是（） A.基因组中没有G B.基因组中没有A C.该细菌的DNA已经过甲基化修饰 D.所有酶切位点都位于基因内，而该限制性内切酶不作用于基因内 E.所有酶切位点都位于启动子及调控区内，而该限制性内切核酸酶只作用于基因内

2. 限制性内切酶的星号活性是指（） 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性 活性大大提高 切割速度大大加快 识别序列与原来的完全不同 3. 下面哪种不是产生星号活性的主要原因（） 甘油含量过高 反应体系中含有有机溶剂 含有非Mg2＋的二价阳离子 酶切反应时酶浓度过低

其它特异性的限制酶 Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子编码，用于rRNA的剪切 5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’ ↑TATT

其它特异性的限制酶 I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子 5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT

DNA的片段化 定义：无论是生物材料制备的天然DNA，还是化学合成的DNA，往往需要用限制性核酸内切酶进行切割，使其可用于连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化 切割方法： 单酶切 双酶切 部分酶切

单酶切 用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品 完全酶切后产生的片段由DNA的形状和酶切位点数决定; 如：线性DNA分子，酶切后的片段＝N＋1

双酶切 用两种不同的酶切割同一种DNA分子 1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 2）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低高盐，不可 同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。

部分酶切 用限制性内切酶对DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割 导致不完全切割的原因：

用 途 确定DNA分子的限制性图谱

限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理 H H E B 待检的DNA 15Kb H E 9Kb Eco RI H E 6Kb H B 10Kb Bam HI H B 5Kb H E 6Kb B E 1Kb 4Kb E+B H B 5Kb

4.9kb Eco RI Eco RI+ Bam HI Bam HI 1.5 0.7 1.0 1.2 2.0 0.2 0.5 1.2 3.4 1.0 2.0 结论2 结论1 B E B B 2.0 1.2 0.7 B E B B 2.0 1.2 0.7

如何确定哪种结论正确？ 答：部分限制性酶切 4.9 Bam HI 1.7 0.7 1.0 2.7 1.2 2.0 3.7 3.9 4.9

酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N

问题 1.为了绘制长为3.0kb的DNA的BamH I限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR I、Hpa II、 EcoR I+Hpa II消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴乙锭染色后观察DNA带型（见图）。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR I和Hpa II识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）

DNA连接酶 特性： DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应是： 将DNA双链上的相邻碱基的5’-PO4和3’-OH共价结合形成 3’-5’磷酸二酯键

DNA连接酶

DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子或环化单链DNA。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口（nick）

分类： DNA连接酶 T4DNA连接酶 Tsc DNA连接酶 区别 ： 催化反应中能量来源不同 连接能力不同 分子量大小

连接反应是一个吸能的反应，E.coli 及其它细菌以NAD为能源，动物及噬菌体以ATP为能源 基因工程中常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶 连接酶的最佳反应温度是37℃，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在4~15℃，Tsc DNA连接酶在90 ℃以上高温仍保持活性。