实验九 厌氧菌、棒状杆菌及分枝杆菌 练习内容 一、常见厌氧菌、棒状杆菌、分枝杆菌的形态染色特性观察。 二、破伤风杆菌的菌落观察。 实验九 厌氧菌、棒状杆菌及分枝杆菌 练习内容 一、常见厌氧菌、棒状杆菌、分枝杆菌的形态染色特性观察。 二、破伤风杆菌的菌落观察。 三、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌在疱肉培养基，紫牛乳培养基中生长情况的观察。 四、Nagler氏反应（示教）

五、产气荚膜杆菌小白鼠毒力试验。 六、白喉杆菌培养特性的观察。 七、Elek氏平板毒力试验 八、结核病人痰标本的直接检查。 九、结核杆菌的分离培养（示教）

目的要求 1．了解各菌的形态及染色特点。 2．了解厌氧培养方法。 3．熟悉焦性没食子酸培养法及破伤风杆菌的菌落特点。 4．熟悉产气荚膜杆菌，破伤风杆菌在疱肉培养基，紫牛乳培养基中的生长情况。

5．了解产气荚膜杆菌的毒力试验及其原理。 6．了解白喉杆菌的培养特性及毒力试验的原理与方法。 7．了解结核杆菌的抗酸染色法和培养特性。

练习一 常见厌氧菌，棒状杆菌，分枝杆菌的形态，染色特性观察 练习一 常见厌氧菌，棒状杆菌，分枝杆菌的形态，染色特性观察 【材料】 破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，肉毒杆菌，脆弱类杆菌，核梭形杆菌，产黑色素类杆菌，白喉杆菌，结核杆菌，卡介苗菌的形态示教片。 【方法】 观察上述各菌形态，染色特点，并绘图注明。

二、厌氧菌及常用厌氧培养法介绍 培养厌氧菌需将培养环境和培养基中的氧气去除，或将氧化型物质还原，降低氧化还原电势才能使细菌生长，厌氧培养法主要分为生物学，化学及物理学三类方法。

（一）生物学法 培养基中含有新鲜的动物或植物组织小片，或加热的肌肉心脑等组织小块，可使厌 氧菌生长。因新鲜组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质如肌肉，脑磷脂中不饱和脂 肪酸的氧化，都能消耗培养基中的氧气，此外厌氧菌与需氧菌共同培养，使环境中的氧被需氧菌消耗，造成缺氧，也有利于厌氧菌的生长。

疤肉培养基：培养基中的熟牛肉渣含有不饱和脂肪酸及谷胱甘肽能吸收培养基中的 氧，使氧化还原电势下降，故适于培养厌氧菌，如在其液面复盖一层无菌凡士林，除可隔绝空气中的游离氧继续进入培并基，形成更为良好的厌氧条件外，尚可借凡士林盖的 上移与否，指示该菌是否产气，盖有凡士林的庖肉培养基，接种前应置于火焰上，微加热先使溶化，然后接种。

（二）化学法 利用还原作用强的化学物质，将环境中或培养基内的氧气吸收或用还原氧化型物 质，降低氧化还原电势。 利用还原作用强的化学物质，将环境中或培养基内的氧气吸收或用还原氧化型物 质，降低氧化还原电势。 硷性焦性没食子酸法：焦性没食子酸的硷性溶液，能迅速吸收氧气，生成深棕色的 焦性没食子橙。

将厌氧菌接种至琼脂平板，取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花—片，在其上放 焦性没食子酸0. 2克及10％氢氧化钠溶液0 将厌氧菌接种至琼脂平板，取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花—片，在其上放 焦性没食子酸0 .2克及10％氢氧化钠溶液0.4毫升，迅速去皿盖，将培养皿于其上，周围以溶化石蜡或胶泥封密，将此玻璃板连同培养皿放37℃孵育24—48小时取出观察。

（三）物理学法 利用密封，抽气等物理方法，以驱除或隔绝环境或培养基中的氧气，使形成厌氧状态，有利于厌氧菌的发育生长。 厌氧罐（缸）法：将欲培养的平皿或试管放入厌氧缸内，另于无盖空平皿放20克钯衣颗粒，并将共放于培养皿上面，将厌氧缸盖好开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氮气，如此抽气和替代三次，最后充以80％N2、10％H2：及10％CO2，混合气体，厌氧缸中残存的氧与氢受钯的催化而合成水，使其中氧气全部消失，将整个厌氧缸故37 ℃孵育箱培养，本法适合于大量厌氧标本的培养。

练习二 破伤风杆菌的菌落观察 【材料】 破伤风杆菌的48一72小时的血平板培养物（焦性没食子酸法） 【方法】（略） 练习二 破伤风杆菌的菌落观察 【材料】 破伤风杆菌的48一72小时的血平板培养物（焦性没食子酸法） 【方法】（略） 观察破伤风杆菌在血琼脂平板上的菌落形态、大小、边缘、表面及溶血情况，记录 结果。

练习三 破伤风杆菌，产气荚膜杆菌在疱肉培养基紫牛乳培养基中生长情况的观查 练习三 破伤风杆菌，产气荚膜杆菌在疱肉培养基紫牛乳培养基中生长情况的观查 【材料】 1．破伤风杆菌，产气荚膜杆菌的48一72小时疱肉培养物。 2．破伤风杆菌，产气荚膜杆菌的48一72小时紫牛乳培养基培养物。

观察培养结果，并详细记录 1．在疱肉培养管中，破伤风杆菌可使肉汤浑浊，肉渣部分消化微变黑，产生少量气体，产气荚膜杆菌使肉渣变粉红色，不被消化，产生大量气体。 2．在紫牛乳管中破伤风杆菌不引起明显变化，产气荚膜杆菌可分解乳糖，产酸将 酪蛋白凝固，析出乳清，同时产生大量气体，冲散凝固的酪蛋白，气势凶猛称为“汹涌发酵现象”是鉴定本菌的特点。

（一）疱肉培养基 【成份】 牛肉渣、肉汤（或肉膏汤）pH7

（二）紫牛乳培养基 【成份】 新鲜牛乳，1.6％溴甲酚紫酒精溶液。 【制法】 1．将新鲜牛乳分装沉淀管中，于离心机内以每分钟2,000转，离心沉淀15分钟。 2．用虹吸管吸出乳汁，注入三角瓶中，弃除乳脂。 3．每1000毫升牛乳内加溴甲酚紫指示剂1毫升，分装试管。

4．用阿诺氏灭菌器间歇灭菌3次，第—日75℃半小时，第二日80℃半小时，第三 日85℃半小时。 5．将灭菌后牛乳培养基置37℃24—48小时，若无菌生长即可使用。

练习四 Nagler氏反应（示教） Nagler氏反应用是测定产气荚膜杆菌卵磷脂酶（甲种毒素）的试验，当琼脂平板中加入适量血清后，在产气荚膜杆菌菌落周围出现不透明的白环，称为Nagler氏反应阳性，不透明白环出现的原因，是因为血清中含有可溶性脂蛋白物质。 此物质经卵磷脂酶作用后，分解为脂类及蛋白类沉淀物。如在培养基中加入特异的抗毒素时，毒素被中和则无沉淀出现，以后有人倡以羊血及鸡蛋黄盐水溶液代替血清，一般以卵磷脂蛋黄素琼脂平板最方便。

【材料】 1．菌种：产气荚膜杆菌疱肉培养物。 2．培养基：卵磷脂蛋黄素琼脂平板。 3．无菌盖玻片、镊子。

【方法】 1．取卵磷脂蛋黄素琼脂平板一个，分成二等分。 2．将产气荚膜杆菌抗毒素2—3滴涂布于平板的半边（用蜡笔标记）待干。 3．将产气荚膜杆菌，先在无抗毒素的一边接种一直径约2—3毫米大小的面积， 然后以同样方法接种有抗毒素的一边作为对照。以后用无菌盖玻片封盖好，但切勿留有 气泡在盖玻片内，放37℃24小时（如不盖好玻片时，则须用厌氧培养法）。

三、白喉杆菌的培养特性 分离培养白喉杆菌时常用亚碲酸钾血琼脂平板，在此培养基上，其它细菌受到抑制，而白喉杆菌则由于生长时吸收碲盐并还原为金属鍗形成黑色或灰色菌落。据菌落的颜色等不同可分为轻型，中间型和重型三个型别

为了获得具有明显异染颗粒及典型的白喉杆菌，需用吕（Loeffler）氏培养基进行培养。 白喉杆菌培养特性的观察 【材料】 1．白喉杆菌6—18小时吕氏血清斜面培养物。 2．白喉杆菌18—24小时亚碲酸钾血琼脂平板培养物。 【方法】 观察白喉杆菌在上述培养基中的生长情况及菌落特点，并做记录。

五、结核杆菌的细菌检查 【材料】 结核病人痰标本，抗酸染色液，铜片、三角架，玻片等。 【方法】 1．用接种环挑取痰液中脓样部分，作成涂片（略厚）。在空气中干燥，经火焰固定后，用抗酸染色法染色。 2．将制成的标本放在铜板上，滴加石炭酸复红液盖没涂膜，铜板下以弱火徐徐加 温，使染液冒蒸气，切勿煮沸烧干，染液将要干时随即添加，如此维持5分钟，熄灭。

3．待标本冷却，水洗。 4．水洗后，用3％盐酸酒精脱色1/2—1分钟，脱色时轻轻摇玻片，直至涂片脱至无色或稍呈粉红色时为止。 5．水洗后，用硷性美蓝液复染1分钟，水洗。 6．用吸水纸印干，油镜检查，记录结果。

练习九 结核杆菌的分离培养（示教） 本菌为专性需氧菌，人工培养时以6.5—6.8pH为最适宜，营养要求特殊，必须在含有血清、卵黄、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上生长，生长速度缓慢，在液体中呈皱壁状生长。固体培养基上菌落呈干燥颗粒状，乳白色或米黄色，不透明，表面呈皱纹状，形似花莱心。 结核杆菌在“Lowenstein—Jensen”培养基上的生长物。

思考题： 1．怎样测定破伤风毒素及产气荚膜杆菌毒素？ 2．“汹涌发酵”现象是什么菌的特点？怎样形库的？ 3．对肺结核可疑患者痰标本做直接涂片检查时未发现抗酸杆菌能否除外结核杆菌感染？还应做哪些微生物学检查?