PCR技术介绍 Introduction to PCR Technology 济南艾迪康医学检验中心有限公司 PCR实验室 杨超

主要内容 一. DNA结构和复制 二. PCR 1. PCR发展简史 2. PCR基本概念 3. PCR原理 三. 荧光定量PCR检测HBV 四.基因芯片技术平台 ——HPV23亚型检测技术

DNA结构和复制 ——DNA结构

H O- O O—CH2 T O=P— 3′ 5′ OH C 碱基 A：腺嘌呤 G：鸟嘌呤 C：胞嘧啶 T：胸腺嘧啶 核糖 磷酸

DNA结构和复制 ——细胞内DNA复制

1.DNA双链的打开 2.引物酶合成RNA引物

3.DNA聚合酶 延长子链

聚合酶链反应的发明 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖

PCR ——基本概念 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

PCR 基本原理 基本组成： 模 板 底 物 DNA聚合酶 引 物 缓冲液 Mg2+ 基本过程： 变 性 退 火（复性） 延伸

模板DNA

72℃ 95℃ 55℃ Taq酶 引物2 引物1 Taq酶

第1轮结束 第2轮开始

DNA模板 DNA引物 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 Mg2+

MJ Research, Inc. PTC-100 PTC-150 PTC-200 PTC-220 PTC-225

ABS, Inc. PE-2400 PE-2700 PE-9600 PE-9700

循环参数 循环参数是指PCR循环中每一步骤的温度、时间以及循环次数 1．变性温度和时间 2. 退火温度和时间 3. 延伸温度和时间 4. 循环数

PCR反应基本过程 1 2 3 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 高温变性 低温退火 适温延伸 重复1~3步 25~30轮 形成2条单链 DNA变性 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

平台期效应

荧光定量PCR (Real-time PCR) 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR标记技术 1. TaqMan探针技术 2. LightCycler 双探针技术 3. 其他

TaqMan探针技术

LightCycler 双探针技术

标本的采集 荧 光 定 量 P C R 工 作 流 程 标本的运送 标本的处理 基因扩增 扩增产物分析

标本的采集 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本采集的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染

标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果

标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其他杂物，但应适度，过度的清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。

标本采集的类型和采集量 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定 HBV 血清或EDTA抗凝血浆200ul TB 痰液 HPV CT 宫颈或尿道分泌物

采样质量的评价 主要观察有无溶血，脂浊，异物等现象

采样及运输容器 标本的采集材料如棉签、注射器应为一次性使用 运输容器亦应为密闭的一次性装置 采集标本所用的防腐剂、抗凝剂及相关材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰 严禁使用肝素抗凝

标本采集中的防污染 标本采集最好用一次性材料，不用处理便可直接使用 采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等 如使用玻璃器皿，必须经250°C干烤4小时或用DEPC水处理，以使可能存在RNAase失活

标本的稳定化处理 用于DNA检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室 用于RNA检测的标本，由于RNA易受RNA酶的降解，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC（异硫氰酸胍盐）的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可运送。

标本的运输 标本采集后必须尽快送至实验室 经过适当稳定化处理的标本可在常温下运送（如 用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于 RNA 扩增检测的经GITC稳定化处理的标本）通 常在运送时应采用不易破碎的容器装载标本 用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则 必须速冻后，放在干冰中运送

标本的保存 临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存 用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris， 1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存 用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃ 或液氮中贮存；用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃ 即可；用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天

实验室分区管理平面图

试剂准备区（Ⅰ 区） 使用所有试剂都已经准备好备用的商品试剂盒 时还需要试剂准备区吗？ 试剂准备区的仪器设备主要有冰箱、超净台、 加样器、混匀器和离心机等。仪器除了要专用 外，还应有定期校准。 试剂的分装应在超净台中进行。

标本处理区（Ⅱ 区） 标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属 浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸 标本处理区（Ⅱ 区） 标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属 浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸 馏水或70%乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠 标本处理需在生物安全柜内进行，防止标本气溶胶的扩散 在标本处理的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换， 以避免因手套的污染导致的标本间的交叉污染 实验时所用的加样器吸头都必须带有滤塞，以防止气溶胶 对加样器的污染

基因扩增检测区（Ⅲ 区） 空白对照 阴性对照 弱阳性对照 标准品（四种不同浓度） 质控品 待测样本

结果分析

结果判断(HBV) 检测样本中1.0× 103copies/ml≤ HBV DNA ≤4.2 × 109copies/ml，测定结果有效，可直接报告拷贝数。 2. 检测样本中HBVDNA> 4.2 × 109copies/ml，既直接报告为> 4.2 × 109copies/ml。 样本检测结果< 1.0 × 103copies/ml，拷贝数仅供参考，报告为< 1.0 × copies/ml 报告模式： 6.666E+06＝6.666 ×106 copies/ml

荧光定量PCR的应用 1. 传染性疾病：了解病原体对人体的感染情况，判断病 情或对某一种药物的疗效进行评估 2. 肿瘤研究：通过对癌基因或抑癌基因mRNA的表达数 量进行检测，来判断肿瘤的发病情况，还可以通过查 找基因的表达差异，推断发病机理 3. 其他（遗传病、环境监测、SNP分析等）

HBV DNA

乙型肝炎病毒

HBV DNA定量检测的意义 判断肝病的病情、预后和传染性 预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效

判断肝病的病情、预后和传染性 对于持续性感染的病毒性肝炎，病毒血症水平的消长与肝脏损害情况和预后相关。 随着病毒感染后肝脏病理损害的进展，病毒核酸逐渐在宿主血液中积蓄，直到发展为肝病晚期时，病毒血症也达到了最高水平，故如果病毒核酸水平升高表示病恶化，预后不良；水平降低说明向好的方向发展。 血中HBV核酸定量水平的高低，也是衡量传染性强弱的最直接量化指标。

预测抗病毒治疗的效果 血中病毒水平，对抗病毒药物的治疗效果，有预报的作用。 病毒水平降低，治疗效果好； 病毒水平升高，治疗效果差。

监测和评价抗病毒药物的疗效 应用抗病毒药物（如干扰素、拉米呋啶等）治疗前和治疗过程中，应定量检测血中病毒水平，以判断病人对药物的应答情况，修正治疗方案和评价疗效。

YMDD突变株 YMDD: 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸 YIDD 突变：蛋氨酸 亮氨酸 YVDD突变：蛋氨酸 缬氨酸

基 因 芯 片 技 术 平 台

DNA芯片技术 以玻璃、硅片作为载体 以膜片作为载体 PCR技术 荧光定量PCR PCR

基因芯片的基本构造 外观 剖面图 平面局部放大 DNA芯片的组成： 1: 支持物：如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜 探针 支持物 外观 剖面图 平面局部放大 DNA芯片的组成： 1: 支持物：如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜 2: 探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的

基因芯片原理 采集标本 提取基因组 DNA/RNA PCR/RT-PCR 扩增 探针杂交 显色/扫描 电泳检测 玻璃片 膜 片 电泳图

DNA样品的获取和目的片段的PCR扩增 扩增区域 PCR扩增和目的片段的标记 Biotin Primer up Primer down

人乳头瘤病毒分型基因检测芯片

人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses, HPV） 双链DNA无包膜病毒 环状DNA，约8Kb 病毒颗粒直径为50～55nm。 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。 广泛分布在高等脊椎动物 有很高的种属特异性 定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮

型别与分布 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分 已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、31、33、35、39 、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等） 某些亚型有地理位置的差异

HPV与宫颈癌 宫颈癌的病因学研究进展 ： 早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。 1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒。 至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授Keerti Shah证实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。 1995年世界卫生组织国际癌症研究所（IARC）专题讨论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。

HPV与宫颈癌 目前已经确定高危型HPV的持续性感染是宫颈癌患病的关键病因 HPV与宫颈癌的发生有95%以上的相关性 宫颈病变CIN3组织切片中HPV的检出率为99.7％

HPV的致癌机理 HPV E6蛋白间接抑制p53活性 HPV E7蛋白与RB蛋白结合，RB蛋白不能抑制 E2F的转录而使细胞分裂增殖 HPV16-E5通过作用CDK抑制剂p27调节表皮生长因子受体信号转导途径

理想的宫颈癌的筛查方案 HPV检测（－） ＋ 细胞学检查（－） ↓ 5—8年复查 HPV检测（＋） ＋ 细胞学检查（＋） HPV检测（－） ＋ 细胞学检查（＋） ↓ ↓ 阴道镜检查 每年复查 ↓ ↑ 组织学检查 HPV检测（＋） ＋ 细胞学检查（－）

人乳头瘤病毒分型基因快速诊断试剂盒 特点 技术先进性 快速诊断HPV的感染，并鉴定HPV亚型 可用于临床诊断和女性常规体检 应用PCR技术和膜杂交技术可同时检测18种高危型和 5种低危型HPV 目前国内同类产品中分析检测通量最大

HPV33、35 HPV16、43

HPV分型检测基因芯片设计原理 HPV16、43 变异区 Primer up 保守区 Primer down HPV18 HPV16

子宫颈癌与人乳头瘤病毒（HPV）的研究进展

一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展 二、HPV的生物学研究 三、宫颈癌的筛查

宫颈癌－－最常见的妇科恶性肿瘤 据世界范围内统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年宫颈癌新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8% ，发病率仅次于乳腺癌位居第二。 随着筛查制度的建立，世界宫颈癌的发病率和死亡率已经大幅下降。我国由70年代的10.28/10万下降到90年代的3.25/10万，但在高发病区，死亡率仍高居不下。 地区 死亡率 (/10万） 世界 8.00 中国 3.25 北京 2.54 上海 3.8 山西阳城 36.00

患病年龄更趋于年轻化（发病年龄提前到45岁），发病史缩短。如吉林省在80年代统计宫颈癌 患者中小于35岁的妇女占4.8％，而2000年已经占到34.1％

子宫颈癌的危险因素： 行为危险因素：如性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、营养不良等； 生物学因素：如细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染。 目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。

型别与分布 型别：已发现100多种不同的亚型（如果DNA序列同源性小于90％，则定为新的亚型）。其中超过35种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。11－37％的女性一生中会感染至少一次HPV。 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42、43、44） ； 2）高危型： 宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、 31、 33、35、 39 、45、 51、 52、 53、56、 58、59、 66、68、73、83及MM4）； 3）中间型：不确定型。 分布：有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，58在中国常见。 在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。

表 HPV型别与宫颈病变 常见HPV型别 宫颈病变 6，11 湿疣，CIN I 16 CIN, 18 CIN 30，40，58，69 31，33，35，39 45，51，52，56 CIN I 42，43，44 53 正常宫颈上皮 54 尖锐湿疣 55 鲍温样丘疹病 59 VIN 61，62，64，67 VaIN 66 鳞癌 70 外阴乳头状瘤

HPV感染率 最常见的低危型（HPV6、11） 最常见的高危型（HPV16、18、31、33、45、58 ） 宫颈癌患者中高危型HPV感染率 Other 宫颈癌患者中高危型HPV感染率

表 不同HPV亚型的检出频率统计表 注：1.本表统计样本数为1153例，其中阳性样本数为119例；   注：1.本表统计样本数为1153例，其中阳性样本数为119例； 由于检测样本中存在复合感染，故亚型的检出频率＝（该亚型的检出次数 / 所有亚型的检出次数）×100％， 所有亚型检出次数为226。 2. 本表统计数据由深圳市计生中心提供，HPV分型基因检测试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司提供。

2001年版TBS（The Bethesda System)报告分类中常见的细胞学诊断宫颈癌前病变的几个术语解释： 未见上皮内病变－－鳞状上皮细胞异常－－腺上皮细胞异常 ASCUS（Atypical Squamous Cells)：非典型鳞状上皮细胞 ASC-US:意义不明确的非典型鳞状上皮细胞 ASC-H：意义不明确的非典型鳞状上皮细胞不除外高度鳞状上皮内病变 L-SIL：低度鳞状上皮内病变－－－－HPV感染、CIN I H-SIL：高度鳞状上皮内病变－－－－与CIN II、CIN III或原位癌含义一致 SCC：鳞状细胞癌 AGC（ Atypical Glandular Cells)：非典型腺上皮细胞 AIS（Adenocarcinoma In Situ)：腺原位癌 CS：腺癌 组织学检查的分类： CIN（Cervical Intraepithelial Neoplasm)：宫颈上皮内瘤变 CIN I：轻度不典型增生 CIN II：中度不典型增生 CINIII：重度不典型增生、原位癌

潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期 一过性，80％ 平均8个月 无细胞学改变/HPV消除 年龄<30岁 正常妇女 HPV暴露 机体免疫机制 辅助致癌因素 HPV CIN I（组织学） 主要是性传播 感染几率：4～15％ 年龄>30岁 CIN II/III（组织学） 子宫颈浸润癌 平均6~24个月 5－10年 潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期 图 HPV感染与宫颈病变的自然过程

说明：CIN级别越高，其消退和逆转的机会越小。 病变 消退（逆转） 持续（稳定） 进展（恶化） 表 CIN级别发展为CC的风险评估 级别 单纯HPV CIN I CIN II CIN III 风险率(%) 5 15 30 45 持续率(%) 37 35 <56 消退率(%) 80 57 43 32 说明：CIN级别越高，其消退和逆转的机会越小。

筛查是早诊早治关键 临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，必须采取适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有望最终根治。 美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于21岁开始。每年筛一次。若2～3次HPV和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时间至5-8年。大于70岁，在10年内已有3次以上满意的细胞学检查和HPV检查正常者，可停止筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则，连续3年检查，可终止。 中国：筛查起始年龄可考虑为25-30岁，65岁以上可停止筛查。

表：筛查间隔时间与阳性病变风险系数表 筛查间隔时间 （年） 1 2 3 3～5 5～10 >10 阳性病变风险系数 2.5 4 9 备注：1～3年筛查间隔比较安全，随着筛查间隔的增加，风险大幅度增加。

宫颈癌的常规临床检测方法 临床检查：如肉眼观察、阴道镜等 细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等 操作简便，但准确率和特异性有待提高（50-70％） 细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等 1）长期宫颈糜烂可导致宫颈上皮细胞形态变异，但非HPV引起的细胞形态异常与宫颈癌病变没有直接联系。 2）在感染早期，细胞往往不会出现形态变化，但此时HPV对细胞内遗传物质的损伤可能已经产生。 病毒学检测：HPV DNA检测（PCR方法），常见方法有：基因芯 片分型检测、荧光PCR等 特异性强、灵敏度高，操作简便快捷 (98%)

中国癌症研究基金会（CCRF）筛查和早诊早治指南： 基本方案：肉眼观察＋冰醋酸试验（碘液试验） 一般方案：pap smear+HPV检测 最佳方案：TCT+HPV检测

HPV检测的应用领域： 一、宫颈癌的筛查 二、评估宫颈癌的治疗疗效

高危型HPV持续感染是导致宫颈癌的主要原因

二、评估宫颈癌的治疗疗效 CIN患者： 成功治疗率达90～95％，复发率10％； 比正常人发生浸润癌的几率高4－5倍； 危险期：8年左右； 常规复查要求：4－6个月，复查HPV、细胞学、阴道镜等。

宫颈癌的筛查是非常重要的， 筛查的对象包括如下人群： 二、即使没有性生活，但年龄超过21岁的女性； 　　一、过早有性生活的女性； 　　二、即使没有性生活，但年龄超过21岁的女性； 　　三、只要保持有性生活的女性，特别是年龄过了30岁以后的女性； 　　四、性伴侣超过1个的女性； 　　五、配偶有其他性伴侣的女性； 　　六、吸烟的女性； 　　七、HIV（艾滋病病毒）感染者； 　　八、患有其他性传染疾病者； 　　九、正在接受免疫抑制剂治疗者； 　　十、有宫颈病变、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌等病史者。

上述人群应该每年做一次宫颈癌筛查，在做筛查前要注意如下问题： 　　一、不要在月经期间做筛查； 　　二、注意在检查前3天内不要冲洗阴道或使用阴道内药物； 　　三、24小时内不要有性生活，以免影响检查结果的准确性。　

谢谢大家