肺結核痰液抹片檢查及鑑定暨臨床教師技能訓練 102.04.25 蔣佳蓉

Identification and Drug susceptible Test Negative pressure room for sputum collection Smear, Culture and PCR Specimen decontamination before treatment

結核桿菌抹片作業

檢驗目的 顯微鏡鏡檢法是在臨床檢體中確認感染分枝桿菌疾病的最快速方法，利用此項檢查能偵測檢體中是否含有分枝桿菌屬。分枝桿菌屬鏡檢法可提供醫生很多用途，包括(1)能迅速確認病人是否被感染，提供作為初步診斷結核菌感染的參考，(2)能監測病人接受藥物治療進行的狀況，(3)確認培養出的菌落為分枝桿菌。

檢驗原理 利用分枝桿菌細胞壁富含mycolic acid的性質，一旦被aniline dye或basic fuchsin染上，就很難被酸性酒精脫色之特性，可與其他菌屬區分出。

原始檢體種類 適用於人體之痰、尿、體液（含腦脊髓液、肋膜液、腹膜液）、胃抽出液、組織、糞便等。

結核菌檢體包裝 檢體須以50mL 離心管密封鎖緊 檢體容器外應標示病患姓名、送驗疾病、barcode 、檢體種類、 採檢部位或其他規定該標示項目 裝入檢體瓶中

結核菌檢體採檢 檢體種類：痰(用力咳出肺部深處的痰)，痰量至少3-5 mL 檢體容器：50mL離心管 採檢時間：初次驗痰應以未服藥前採檢為宜，建議採集三次；至少有一次為清晨第一口痰檢體為佳

檢驗項目 抗酸菌染色檢查。 結核菌培養檢查。 抗酸菌鑑定 抗酸菌藥物敏感性試驗 健保結核分枝桿菌分子檢測(PCR)。 QuantiFERON-TB試劑分析結核病患者之高危險潛伏族群(疾病管制局委託執行) 。 Geno-type(MDR)

痰檢體(濃縮法) 1 以無菌滴管吸取3-5 mL痰液至50 mL離心管 2 加等量的無菌NALC-3.5%NaOH液化痰液 3 振盪器振盪約15-20秒。(如痰未液化完全，則依需要再振盪幾秒但時間不宜超過30秒) 4 室溫靜置15分鐘

Microscopy fluorescent stain + - acid fast stain Microscopy Negative results acid fast stain

抹片判讀

注意事項 - 避免酸性酒精脫色不完全 大部份結核菌為強抗酸菌不容易被脫色，若酸性酒精脫色不完全會造成偽陽性。抹片太厚不易脫色時，加上背景染色容易掩蓋抗酸菌造成偽陰性 - Ziehl-Neelsen法之Carbolfuchsin濃度較低(0.3%)，需加熱較麻煩，但放久較不會褪色。Kinyoun法則複紅濃度較高(3%)，不必加熱，較方便，但可能較會褪色。國際抗癆聯盟專家，較推薦Ziehl-Neelsen法

結核菌的鑑定方法 傳統鑑定 ICA(快速鑑定) PCR 生物晶片分型 PCR-RFLP 基因定序(Sequence)

Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium africanum Mycobacterium microti PCR Target- 273 bp IS6110 fragment

結核桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex) 結核菌的鑑定目的 利用相關檢測陽性培養菌株，鑑定是否為 結核桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex) 非結核性分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria)。

ICA (快速鑑定) 檢驗原理 利用快速免疫呈色法，針對結核菌群(MTbc)抗原進行定性偵測。本產品偵測結核菌群細胞分泌的MPT64蛋白片段，當檢體與試劑進行反應時，檢體中的MPT64抗原會與試劑中的MPT64抗體結合，MPT64抗原-抗體複合物會在試劑的反應區被次級MPT64抗體所辨認結合進而由膠狀金質顆粒產生紅色至粉紅色的線條顏色

ICA (快速鑑定) 1.MGIT tube呈現陽性之後經抗酸性染色確定陽性再用 ICA(快速鑑定)試劑組。 液體培養基 1.MGIT tube呈現陽性之後經抗酸性染色確定陽性再用 ICA(快速鑑定)試劑組。 2.ICA(快速鑑定) 試劑組必須回溫至室溫下使用。 3.拆開試劑包裝並放置於平坦的桌面。 4.在試劑上標明病人資料。 5.將呈現陽性的MGIT tube均勻混合。 6.打開MGIT tube蓋子，用無菌的pipette tips或無菌吸 管取100 μl檢體加到已標示病人資料的試劑區，關上 MGIT tube蓋子， 開始計時15分鐘後進行判讀，切勿 超過60分鐘判讀。

ICA (快速鑑定) 固體培養基 取菌落3-4個菌落加入200μl7H9broth或無菌 水調成懸浮液。如固體培養基內有凝結液直接用 無菌的pipette tips或無菌吸管取凝結液100 μl檢體加到已標示病人資料的試劑接種區(標示 為 )開始計時15分鐘後進行判讀，切勿超過60分 鐘判讀。

生物晶片(Myco Chip)效能 利用核酸放大及雜交反應之定性方法，篩檢經過培養之抗酸染色陽性檢體，可檢測肺結核分枝桿菌以及15種非結核分枝桿菌分型，同時鑑定肺結核分枝桿菌對Rifampicin 的藥物敏感性。

DR. Chip Biotechnology Incorporation Microarray Plate DR. Poly Chip 96-well Microplate

DR. AiM Soft analysis result － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ×

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