生物化学实验 (代谢部分) 指导教师:王国彦

实验一 氨基转移反应的定性鉴定 实验目的 1. 学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理； 2. 进一步掌握纸层析的原理和操作技术； 1.  学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理； 2.  进一步掌握纸层析的原理和操作技术； 3.  了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。

实验原理 氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。它们催化的反应如下：

上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。 本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。

试剂和器材 1. 试剂 (1) 实验动物----家兔 (2) 1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4） 1.  试剂 (1) 实验动物----家兔 (2) 1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4） (3) 1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性） (4) 1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性） (5) 0.1%碳酸氢钾溶液 (6) 0.05%碘乙酸溶液 (7)15%三氯醋酸溶液

(8) 标准丙氨酸溶液(0.1%) (9) 标准谷氨酸溶液(0.1%) (10)0.1%水合茚三酮乙醇溶液 (11)酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40ml，再加入新蒸馏的无色的苯酚150g。在水浴中加热搅拌，混合至酚完全溶解。将该溶液倒入盛有100ml蒸馏水的500ml分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7-10h，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液（即酚溶剂），放出下层，贮存在棕色试剂瓶中备用。

2.  器材 (1) 解剖刀、剪及镊子。 (2) 解剖盘。 (3) 表面皿。 (4) 匀浆器。 (5) 台秤。 (6) 离心管和离心机（台式） (7) 试管及试管架 (8) 恒温水浴 (9) 毛细玻璃管

(10)直尺 (11)2H铅笔 (12)层析滤纸（国产新华1号滤纸） (13)电热鼓风干燥箱 (14)层析用具：玻璃钟罩、层析缸和小烧杯。 针、线、喷雾器。

操作方法 1.  酶液的制备 将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3ml磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500r/min的条件下，离心5min，取上清液，即为制备的酶液。

2.体外氨基移换反应 取2支试管，编号。向1号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15min，做对照管。向2号试管中加入酶液10滴，然后向1、2号试管中各加入1%谷氨酸溶液10滴、1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴和0.05%碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37℃-40℃恒温水浴中保温1.5-2h。在保温过程中，将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即向第2号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴以沉淀蛋白质终止酶反应。将2支试管的内容物分别离心，2500r/min,5min。将上清液转移到试管中，用塞塞紧放置于低温处备用。

3.纸上层析法检查 两人合用一张滤纸(宽15cm，长20cm)，在其一端距边缘1.5cm处，用铅笔轻画一条与纸边平行的直线做为层析基线，在基线上每隔2cm用铅笔点一小点，共8点，点外画一半径为1.5mm的小圆圈。如图所示：

每人4个点（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液）。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2-3mm的圆斑，每次点样后，自然风干或吹风机吹干，再点下一次，重复3-4次，点样量应均匀相等。完成点样后，将滤纸卷成圆筒，用线将两端缝合，并留一宽缝，以免接触产生毛细现象。缝好后放入层析罩内。

用被酚所饱和的水溶液，平衡20min后，用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂，用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，放入60-80℃烘箱中显色10-15min。 氨基酸与茚三酮反应，在滤纸上呈现紫红色斑点。

实验二 脂肪酸的β-氧化 实验目的 1.了解脂肪酸的β-氧化作用； 2.  通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方法及其原理。

实验原理 根据β—氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。

本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下： 2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH 碘仿 剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。 NaOI+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。

试剂和器材 1. 材料 动物：家兔 2. 试剂 (1)Locke氏溶液：取0.9g氯化钠、0.042g氯化钾、0.024g 1.  材料 动物：家兔 2.  试剂 (1)Locke氏溶液：取0.9g氯化钠、0.042g氯化钾、0.024g 氯化钙、0.015g碳酸氢钠及0.1g葡萄糖，溶于水中，稀释到100ml (2)0.1mol/L碘溶液:称取12.7g碘和约25g碘化钾,溶于水中,稀释到1000ml,混匀,用标准硫代硫酸钠溶液标定.

(3)pH7.6,mol/L的磷酸缓冲液. (4)0.2mol/L丁酸溶液:取18ml正丁酸,用1mol/L氢氧化纳溶液中和至pH=7.6,并稀释至1000ml。 (5)15%三氯乙酸溶液。 (6)10%氢氧化钠溶液。 (7)10%盐酸溶液。

3.  器材 玻璃皿 锥形瓶（50ml） 试管及试管架 移液管(2.5ml) 漏斗 微量滴定管(5ml) 剪刀及镊子 小台秤 恒温水浴

操作方法 击毙动物（家兔），迅速放血，取出肝脏，在玻璃皿上剪成碎糜。 取50ml锥形瓶2个，各加入3ml Locke氏溶液和2ml pH7.6的磷酸缓冲液。在一个锥形瓶中，加入3ml0.2mol/L丁酸溶液，另一个锥形瓶作为对照。取约0.5g肝组织两份（相等重），分别置于两个锥形瓶内，混匀，于37℃恒温水浴内保温。

保温2小时后，取出锥形瓶，各加入2ml 15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加3ml 0 保温2小时后，取出锥形瓶，各加入2ml 15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加3ml 0.2mol/L丁酸溶液。混匀，静置15min后过滤，分别吸取5ml滤液，放入另外两个锥形瓶中，各加5ml 0.1N碘溶液和10%NaoH 5ml，摇匀后静置10分钟加入5ml 10% HCl中和。然后，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，加几滴淀粉溶液作指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色消失，记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠的毫升数，并按式计算样品丙酮含量：

丙酮含量=（B－A）×0.9667×10 5 式中，B为测定对照实验所消耗的0.1mol/L硫代硫酸钠溶液ml数；A为滴定样品所消耗的0.1mol/L硫代硫酸的溶液ml数；0.9667为1ml 0.1mol/L硫代硫酸钠溶所相当的丙酮mg数。

思考题: 1.什么叫氨基移换(或转氨基)作用? 试说明该作用得特点,及在中间代谢中得意义. 2.为什么说脂肪酸β-氧化实验的关键是制备新鲜的肝糜? 3.什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少?