药物的杂质检查(二） Impurity test of drugs

第一节 概 述 一、药物纯度及其要求 二、杂质的来源与种类 三、杂质的限量

氯化物检查（ChP2010二部附录ⅧA） 第二节 一般杂质的检查方法 原理: 利用药物中的微量氯化物在硝酸酸性条件下与硝酸银反应，生成氯化银交替微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液在相同条件下产生的氯化银浑浊程度比较，判断供试品中氯化物是否符合限量规定。

操作方法 取各药品项下规定量的供试品，加水溶解使成25ml，再加稀硝酸10ml；置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，摇匀，即得供试溶液。另取各药品项下规定量的标准氯化钠溶液，置50ml纳氏比色管中，加稀硝酸10ml，加水使成40ml，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0ml，用水稀释至50ml，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，即得。

《中国药典》葡萄糖中氯化物的检查 氯化物 取本品0.60g，依法检查（附录ⅧA），与标准氯化钠溶液6.0ml制成的对照液比较，不得更浓（0.01%）。

特别注意：带色供试品中氯化物检查 内消色法 取供试品溶液两份，于其中一份中先加入硝酸银试液，如显浑浊，可反复滤过（滤纸事先用含有硝酸的水洗净其上的氯化物），至滤液澄清，即得无氯化物杂质又具有相同颜色的澄清溶液，再加入规定量的标准氯化钠溶液与水适量，作为对照溶液；另一份中加入硝酸银试液1.0ml与水适量使成50ml，作为供试溶液，再依法检查。

不同溶解性质的供试品  溶于水的有机药物，可直接依法检查；  不溶于水的有机药物，多数采用加水振摇，使所含氯化物溶解，滤除不溶物或加热溶解供试品，放冷后析出沉淀，滤过，取滤液依法检查；  溶于稀乙醇或丙酮中的有机药物，可加稀乙醇或丙酮溶解后依法检查。

硫酸盐检查法（ChP2010二部附录ⅧB） 铁盐检查法（ChP2010二部附录ⅧG） 第二节 一般杂质的检查方法 硫酸钡白色浑浊纳氏比色管比浊 铁盐检查法（ChP2010二部附录ⅧG） 红色可溶性硫氰酸铁配离子纳氏比色管比色

Limit Test for Heavy Metals 第二节 一般杂质的检查方法 重金属检查法 Limit Test for Heavy Metals ChP2010二部附录ⅧH

1.重金属元素的危害 定义：在实验条件下能与S2-作用显色的金属杂质，如银、铅、汞、铜、镉、铋、锑、锡等。与体内酶蛋白上的SH和S=S键牢固结合,从而使蛋白质变性失活。 铅:损害神经系统，造血系统，血管和消化系统； 汞:损害肾脏，造成肾功能衰竭。 重金属以铅为代表。

2.硫代乙酰胺法（第一法） 1）原理 硫代乙酰胺在弱酸性（pH3.5醋酸盐缓冲液）条件下水解，产生硫化氢，与微量重金属离子生成黄色到棕黑色的硫化物均匀混悬液。 CH3CSNH2+H2O CH3CONH2+H2S H2S+Pb2+ PbS+2H+

2）操作方法 取各药品项下规定量的供试品，加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml与水适量使成25ml，加硫代乙酰胺试液2ml，放置2分钟后，与标准铅溶液一定量按同法制成的对照液比较（置白纸上，自上向下透视），以判断供试品中重金属离子是否超过限量。 第一法适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物，为最常用方法。

3）讨论 （1）适宜目视比色范围为每25ml溶液中含10g -20g的Pb，相当于每1ml含10gPb的标准铅溶液1ml-2ml。 （2）溶液的pH值在3-3.5，硫化铅沉淀较完全。用醋酸盐缓冲液（pH3.5）控制溶液pH值。 （3）供试品如有色： 在对照溶液管中滴加少量稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液 ； 取两倍量供试品，分成两等份，在一份中加硫代乙酰胺试液，用滤膜滤除金属硫化物沉淀后，加入标准铅溶液作为对照溶液，再与另1份供试溶液比较。

（4）铁盐存在 微量高铁盐：加抗坏血酸或盐酸羟胺 供试品中若有微量高铁离子存在，在弱酸性溶液中将氧化硫化氢而析出硫，产生浑浊，影响比色。可先加抗坏血酸0.51.0g，使高铁离子还原为亚铁离子，再按常规步骤检查。

重金属检查法 重金属与有机药物结合怎么办？ 重金属不溶于酸水怎么办？ 重金属量很低怎么办？

3.炽灼后的硫代乙酰胺法（第二法） 适用于含芳环、杂环及难溶于水、稀酸及乙醇的有机药物。 1）操作方法：精密称取规定量供试品置坩埚中，在电炉上缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5-1.0ml，使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽，加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在500-600℃（马福炉）炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，微热溶解，转移入纳氏比色管，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml，依第一法检查。

2）讨论 （1）炽灼温度：温度太低，灰化不完全；温度太高，重金属损失越多，如铅在700℃经6小时炽灼，回收率仅为32%。应控制在500~600℃炽灼使完全灰化。 （2）炽灼残渣加硝酸加热处理后，必须蒸干除尽氧化氮，否则亚硝酸可使硫化氢氧化析出硫。 （3）为了消除盐酸或其他试剂中可能夹杂重金属的影响，对照溶液应取同样、同量试剂在坩埚中蒸干后，依法检查。(空白试验) （4）含钠盐或含氟的有机药物在炽灼时能腐蚀瓷坩埚，应改用铂坩埚。

4.硫化钠法（第三法） 适用于溶于碱性水溶液而难溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的药物。 操作方法：取规定量的供试品，加氢氧化钠试液5ml和水20ml使溶解后，加硫化钠试液5滴，再与一定量标准铅溶液经同样处理后的颜色进行比较。

司可巴比妥钠中重金属的检查 取本品1.0g，依法检查（附录ⅧH第三法），含重金属不得过百万分之二十（20ppm）。 硫化钠试液对玻璃有一定的腐蚀性。 硫化氢试液有恶臭和毒性，不稳定，浓度也难以控制，应临用新配。

5.微孔滤膜法（第四法） 重金属限量低时，用纳氏比色管难以观察，用微孔滤膜滤过，重金属硫化物沉积于微孔滤膜上形成色斑，与一定量的标准铅溶液同法处理后产生的色斑比较，确定重金属是否超过限量。 EUROPEAN PHARMACOPOEIA 6.0, (2008) HEAVY METALS METHOD E

待测液 注射器转移、压滤 滤膜 垫圈 滤器上盖部分 连接头 尼龙垫网 滤器下盖部分 微孔滤膜过滤法检重金属装置

重金属检查法 第一法：硫代乙酰胺法，适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物。 第二法：有机破坏法，适用于含芳环、杂环以及难溶于水、稀酸、乙醇的有机药物。 第三法：碱溶解法，适用于溶于碱性水溶液而难溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的药物。 第四法：微孔滤膜法，适用于含2-5µg重金属杂质的检查。

Limit Test for Arsenics 第二节 一般杂质的检查方法 砷盐检查法 Limit Test for Arsenics ChP2010二部附录ⅧJ

砷元素的危害 砷为毒性杂质，扩张毛细血管，麻痹血管舒缩中枢，使腹腔脏器严重充血，引起肝、肾、心等实质器官的损害。

（一）古蔡（Gutzeit）氏法 原理 利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸产生黄色至棕色的砷斑，与一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判定药物中砷盐的含量。其反应式如下： As3++3Zn+3H+ AsH3+3Zn2+ AsO33-+3Zn+9H+ AsH3+3Zn2++3H2O AsH3+2HgBr2 2HBr+AsH(HgBr)2 黄色 AsH3+3HgBr2 3HBr+As(HgBr)3 棕色

溴化汞试纸 C 醋酸铅棉花 标准品 样品 B A Gutzeit法检砷装置 反应液

标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液2ml(1μg/ml)，置A瓶中，加盐酸5ml与水21ml，再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将装妥的导气管C密塞于A瓶上，并将A瓶置25~40℃水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。 取按各品种项下规定方法制成的供试品溶液，置A瓶中，照标准砷斑制备方法操作，将供试品砷斑与标准砷斑比较，不得更深。

《中国药典》葡萄糖中砷盐的检查 砷盐 取本品2.0g，加水5ml溶解后，加稀硫酸5ml与溴化钾溴试液0.5ml，置水浴上加热约20分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾溴试液适量，并随时补充蒸散的水分，放冷，加盐酸5ml与水适量使成28ml，依法检查（附录ⅧJ第一法），应符合规定（0.0001%）。

Q1：供试品2.0g与标准砷溶液2ml形成的砷斑比较的做法(1)，供试品1.0g与标准砷溶液1ml形成的砷斑比较的做法(2)，哪个合适？

（二）二乙基二硫代氨基甲酸银法 (Ag-DDC法) 原理 砷化氢与Ag(DDC)吡啶溶液作用，使Ag(DDC)中的银还原为红色胶态银，与相同条件下一定量标准砷溶液所呈色用目视比色法或在510nm处测定吸收度，进行比较。

（三）次磷酸法 原理 在盐酸酸性液中，次磷酸将砷盐还原为棕色的游离砷，与一定量的标准砷溶液用同法处理后所显颜色比较，来控制药物中的砷限量。 原理 在盐酸酸性液中，次磷酸将砷盐还原为棕色的游离砷，与一定量的标准砷溶液用同法处理后所显颜色比较，来控制药物中的砷限量。 ——用于硫化物、亚硫酸盐及含锑药物等的砷盐检查时不产生干扰，但灵敏度比古蔡氏法低。

各国药典砷盐检查法 ChP（2010） 古蔡氏法、Ag（DDC）法 Ph.Eur.(2008) 古蔡氏法、次磷酸法 USP（2009） Ag（DDC）法

易炭化物检查法（ChP2010二部附录ⅧO）检查药物中遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有机杂质。 第二节 一般杂质的检查方法 溶液颜色检查法（ChP2010二部附录ⅨA） 控制药物中有色杂质的含量。与标准比色液比较、分光光度法或色差计法。 易炭化物检查法（ChP2010二部附录ⅧO）检查药物中遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有机杂质。 溶液澄清度检查法（ChP2010二部附录ⅨB） 澄清度是检查药品溶液的混浊程度，反映不溶性杂质的存在情况（特别是用作注射剂的原料药纯度控制）。

第二节 一般杂质的检查方法 炽灼残渣检查法（ChP2010二部附录ⅧN） 有机药物经炽灼炭化，至完全灰化，使非挥发性无机杂质（多为金属的氧化物或盐类）成为硫酸盐，称为炽灼残渣。(700-800℃) 干燥失重测定法（ChP2010二部附录ⅧL）药物在规定条件下经干燥后所减失的重量，以百分率表示。主要控制药物中的水分，也包括其他挥发性物质如乙醇等。 水分测定法（ChP2010二部附录ⅧM ） 药物中的水分包括结晶水和吸附水。ChP和USP均收载费休氏法和甲苯法测定药物中的水分。

残留溶剂测定法（ChP2010二部附录ⅧP） 苯/benzene bp 80.1℃ 氯仿/chloroform bp 61.2℃ 1,4-二氧六环/dioxane bp 101.4℃ 二氯甲烷/dichloro-methane bp 40.0℃ 吡啶/pyridine bp 115℃ 甲苯/toluene bp 110.6℃ 环氧乙烷/ethylene oxide bp 11℃ 种类多，毒性大，检测要求高。

残留溶剂测定法 确定残留溶剂的研究对象 残留溶剂分类 残留溶剂表示方法 A.允许日接触量 PDE B.浓度限度(%)=

药物中常见残留溶剂及其限度 第一类溶剂（毒性大且有致癌并对环境有害，避免使用） 溶剂名称 PDE值(mg/天) 限度(%) 苯 0.02 0.0002 四氯化碳 0.04 0.0004 1,2-二氯乙烷 0.05 0.0005 1,1-二氯乙烷 0.08 0.0008 1,1,1-三氯乙烷 15.0 0.15

第二类溶剂（对人有一定毒性，限制使用） 溶剂名称 PDE值(mg/天) 限度(%) 乙腈 4.1 0.041 氯苯 3.6 0.036 三氯甲烷 0.6 0.006 环己烷 38.8 0.388 1,2-二氯乙烯 18.7 0.187 二氯甲烷 6.0 0.06

第二类溶剂 溶剂名称 PDE值(mg/天) 限度(%) 乙二醇 6.2 0.062 甲酰胺 2.2 0.022 正已烷 2.9 0.029 甲醇 30.0 0.3 甲基环已烷 11.8 0.118

第二类溶剂 溶剂名称 PDE值(mg/天) 限度(%) N-甲基吡咯烷酮 5.3 0.053 吡啶 2.0 0.02 甲苯 8.9 0.089 N,N-二甲氧基甲酰胺 8.8 0.088 1,4-二氧六环 3.8 0.038

第三类溶剂（对人健康危险性较小，推荐使用） 溶剂名称 PDE值(mg/天) 限度(%) 乙酸 50.0 0.5 丙酮 正丁醇 二甲亚砜 乙醇

第三类溶剂 溶剂名称 PDE值(mg/天) 限度(%) 乙酸乙酯 50.0 0.5 乙醚 正丙醇 异丙醇 异丁醇

第四类溶剂（尚无足够毒性资料的溶剂） 1,1-二乙氧基丙烷 1,1-二甲氧基甲烷 2,2-二甲氧基丙烷 异辛烷 异丙醚 甲基异丙基酮 甲基四氢呋喃 石油醚 三氯乙酸 三氟乙酸

残留溶剂测定法—— 气相色谱法 1.色谱柱 毛细管柱、填充柱 2.系统适用性试验 理论板数N不低于5000（毛细管柱） 1000（填充柱） 相邻峰分离度R大于1.5 精密度RSD 内标法不大于5% 外标法不大于10%

残留溶剂测定法—— 气相色谱法 3.供试品溶液的制备 顶空进样 0.1-1g供试品，水、DMF、DMSO 溶液直接进样 水或合适溶剂 溶液直接进样 水或合适溶剂 4.对照品溶液的制备 水作溶剂或50% DMF、DMSO溶解后再用水逐步稀释 限量检查：根据限量配制对照品浓度 定量测定：接近供试品残留量的浓度

残留溶剂测定法—— 气相色谱法 5.测定法 第一法 毛细管柱顶空进样等温法 检查有机溶剂残留的数量不多，且极性差异 第一法 毛细管柱顶空进样等温法 检查有机溶剂残留的数量不多，且极性差异 较小的供试品 第二法 毛细管柱顶空进样系统程序升温法 检查有机溶剂残留的数量较多，且极性差异 较大的供试品 第三法 溶液直接进样法 可采用填充柱，亦可采用适宜极性毛细管柱

示例 大孔树脂有机溶剂残留 大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物,应用大孔树脂进行分离的技术是20 世纪60 年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一 物理化学稳定性高 比表面积大 吸附容量大 选择性好 吸附速度快 解吸条件温和 再生处理方便 使用周期长 宜于构成闭路循环 节省费用

溶剂残留的引入 大孔吸附树脂主要以苯乙烯、а- 甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成,多为球状颗粒,直径一般在0. 3～1. 25 mm 之间,通常分为非极性、弱极性和中极性。 主要存在正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯（对于树脂的检测） 洗脱过程采用不同比例的乙醇，因此也存在乙醇的残留（主要存在于产品中）

乳癖消原料药（提取物）中 有机溶剂残留的测定 乳癖消原料药的制备 取昆布、漏芦等14味药材按处方比例称取后加水煎煮两次，合并两次提取液滤过，滤液减压回收浓缩，上样D-101大孔树脂，静止吸附，采用梯度洗脱：水—20％乙醇—75％乙醇。收集醇洗部分，减压回收乙醇后喷雾干燥，成细粉。 可能残留的溶剂——乙醇——第三类溶剂，限度0.5％

实验部分 色谱条件 仪器：岛津GC-14B气相色谱仪 色谱条件： SIMPLICITY-5 30m×0.32mm×0.25m毛细管柱 FID检测 分流比30:1，进样量1l。 进样分析开始毛细管60℃恒温6min，而后程序升温40C /min至200C，并维持1min。

实验部分 系统适用性试验： 理论塔板数以乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯色谱峰计算应不低于5000； 乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯与内标物正庚烷的色谱峰分离度应大于1.5； 以内标法测定时，所得待测物与内标物色谱峰面积之比的相对标准偏差应不大于5%。

tR2.170 乙醇 tR2.410 正己烷 tR2.682 苯 tR2.845 正庚烷（内标） tR3.487 甲苯 tR5.355 对二甲苯 tR5.982 苯乙烯 tR9.008、9.097 9.338、9.462 二乙烯苯

乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯 和正庚烷气相色谱分离系统评价 峰号 保留时间 半峰宽 理论塔板数 分离度 1 2.170 0.035 21361.238 0.000 2 2.410 0.028 40248.402 3.816 3 2.682 0.037 29817.514 4.231 4 2.845 36690.641 2.209 5 3.487 0.055 22306.695 7.130 6 5.355 0.087 21163.854 1.546 7 5.982 0.103 18615.832 3.333 8 9.008 0.032 448989.938 22.407 9 9.097 0.033 412739.375 1.282 10 9.338 0.030 536983.625 11 9.462 446676.969 1.974

线性范围与最低检测限 序号 浓度（g/ml） 峰面积比(A乙醇/A内标) 1 10.38 0.03140.003 2 20.76 0.06240.002 3 51.90 0.15370.004 4 103.8 0.30750.001 5 207.6 0.59470.044 6 519.0 1.51800.024 7 1038 3.05660.045 Y=-0.0024+0.0029C r=0.9999 取标准曲线线性方程制备项下的最低浓度标准溶液，通过不同比例稀释后进行测定，在信噪比值约为3的条件下，最后一次测得积分值的浓度为最低检出浓度，其中乙醇最低检测限约为5.190g/ml

线性范围与最低检测限 乙醇标准曲线线性方程(n=5) Y=-0.0024+0.0029C r=0.9999 乙醇约为5.190g/ml 正己烷约为5.380g/ml 苯约为0.7350g/ml 甲苯约为5.000g/ml 对二甲苯约为5.420g/ml 苯乙烯约为6.340g/ml 二乙烯苯约为6.400g/ml

精密度试验(重复性) 取上述标准溶液系列中的4号标准溶液，按气相色谱测定条件连续进样5次，计算乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和内标物正庚烷的峰面积比值 序号 A乙醇 /A内标 A正己烷 /A内标 A苯 /A内标 A甲苯/A内标 A对二甲苯/A内标 A苯乙烯/A内标 A二乙烯苯/A内标 1 0.2972 0.4948 0.1974 0.5372 0.5433 0.5633 0.8097 2 0.3045 0.5070 0.1986 0.5401 0.5422 0.5648 0.8072 3 0.3015 0.5012 0.2017 0.5390 0.5399 0.5595 0.7927 4 0.3021 0.5027 0.2013 0.5410 0.5371 0.5646 0.8015 5 0.2987 0.4956 0.1989 0.5489 0.5393 0.5617 0.7958 mean 0.3008 0.5003 0.1996 0.5412 0.5403 0.5628 0.8014 RSD(%) 0.9605 1.0181 0.9278 0.8354 0.4547 0.3961 0.9039 <5％

样品测定 取3个批号的样品1.2～1.3g，用N,N-二甲基甲酰胺超声溶解，过滤，收集滤液，并定容至50ml容量瓶内，上机测定 比值 浓度（ g/ml ） 限量（％） 对照 0.0613 20.25 批号1 0.0453 14.96 0.062（1.213g） 批号2 0.0498 16.45 0.067（1.226g） 批号3 0.0553 18.27 0.073（1.247g） 实际样品中主要残留的是乙醇

第三节 特殊杂质检查 一、利用药物和杂质在物理性质上的差异 二、在化学性质上的差异 三、在色谱性质上的差异 四、在光谱性质上的差异 第三节 特殊杂质检查 检查药物中存在的微量杂质，首要的 问题是选择一个专属性强的方法。 一、利用药物和杂质在物理性质上的差异 二、在化学性质上的差异 三、在色谱性质上的差异 四、在光谱性质上的差异

一、色谱分析法 色谱法具有高分离效能，专属性强，是检查有关物质的首选方法。 TLC HPLC GC ……

TLC 1.杂质对照品法 制备一定浓度的供试品溶液和相应的(浓度符合限度规定的)杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液，点样、展开、检测并比较。供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点(杂质斑点)与相应的杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液色谱图中的主斑点比较，颜色(或荧光)不得更深。

TLC 2.自身稀释对照法 制备一定浓度的供试品溶液；取供试品溶液一定量，按照限度规定，稀释制成另一低浓度溶液或系列溶液，作为对照溶液，点样、展开、检测并比较。供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点(杂质斑点)与相应的自身稀释对照溶液或系列自身稀释对照溶液色谱图中的主斑点比较，颜色(或荧光)不得更深。

TLC 3.杂质对照品法与自身稀释对照法并用 即特定杂质限度采用杂质对照品法，其他杂质限度采用供试品溶液自身稀释对照法控制。通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量。

4.对照药物法 当无适合的杂质对照品或供试品中杂质斑点颜色与主成分斑点的颜色有差异，难以判断其限量时，可用与供试品相同的药物作为对照品，此对照药物中所含待检杂质需符合限量要求，且稳定性好。 ChP采用TLC检查马来酸麦角新碱中的有关物质 样品溶液：供试品溶液（1）5mg/ml、供试品溶液（2）0.2mg/ml ，对照品溶液5mg/ml； 试验结论：供试品溶液（1）主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同；如显杂质斑点，其颜色与对照品溶液对应的杂质斑点比较，不得更深，并不得显对照品溶液以外的杂质斑点；供试品溶液（2）除主斑点外，不得显任何杂质斑点。

HPLC 高效液相色谱法分离效能高、专属性强和检测灵敏度高，可以准确地测定供试品各组分的峰面积，在杂质检查中的应用日益增多。特别是选择HPLC测定含量的药物，可采用同一色谱条件进行杂质检查。

ChP采用HPLC法对胰岛素中相关蛋白质的检查，按面积归一化法计算，A21脱氨胰岛素不得大于5.0%，其他相关蛋白质不得大于5.0%。 1.峰面积归一化法 样品峰 溶剂峰 ChP采用HPLC法对胰岛素中相关蛋白质的检查，按面积归一化法计算，A21脱氨胰岛素不得大于5.0%，其他相关蛋白质不得大于5.0%。

样品峰 溶剂峰 样品液稀释 样品液 2.不加校正因子主成分自身对照法 3.加校正因子的主成分自身对照法

HPLC 不加校正因子的主成分自身对照法 ChP采用HPLC法对头孢克肟中有关物质的检查，采用不加校正因子的主成分自身对照法，即供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3%），供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍的峰可忽略不计。

HPLC 加校正因子的主成分自身对照法 ChP采用HPLC法对红霉素中红霉素B、C组分及有关物质的检查，采用加校正因子的主成分自身对照法，即红霉素B按校正后的峰面积计算（乘以校正因子0.7）和红霉素C峰面积均不得大于对照溶液主峰面积（5.0%）。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，红霉素烯醇醚、杂质1按校正后的峰面积计算（分别乘以校正因子0.09、0.15）和其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.6倍（3.0%）；其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（5.0%），供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰可忽略不计。

4.杂质对照品法测定杂质含量 杂质对照品 样品峰 杂质峰 ChP采用HPLC法对二羟丙茶碱有关物质中茶碱的检查，按外标法以峰面积计，不得过0.5%。

示例 头孢克肟中有关物质检查 取含量测定项下的样品溶液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释定容至100ml，制成浓度为样品溶液的1/100的对照溶液

HPLC 取对照溶液20μl注入液相色谱进行预试，调节灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的20～25％，与含量测定项下的供试品溶液比较，供试品溶液的色谱图中如果有杂质峰（溶剂峰除外），杂质峰面积的综合不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3％） 采用自身对照方法 计算： 有关物质（3％）＝ ×3％ ∑A-A主峰 A`主峰×3

主峰 ∑A

A`主峰

HPLC ∑A-A主峰 A`主峰×3 计算： 有关物质（3％）＝ ×3％ ＝（121.588-119.6601）/（1.3031×3）×3％ 有关物质（3％）＝ ×3％ ＝（121.588-119.6601）/（1.3031×3）×3％ ＝1.48％ ∑A-A主峰 A`主峰×3

GC 气相色谱法用来测定药物中挥发性特殊杂质，特别是药物中的残留溶剂的检查，各国药典均采用气相色谱法。

GC 检查方法 内标法、外标法、面积归一化法和标准溶液加入法。 检查方法 内标法、外标法、面积归一化法和标准溶液加入法。 标准溶液加入法 精密称(量)取杂质对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品中某个杂质的含量。

GC示例 ChP采用内标法对头孢地嗪钠中的残留溶剂进行检查，按内标法以峰面积比值计算，含乙醇不得过2.0%； 采用外标法对氨苄西林钠中的残留溶剂进行检查，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷不得超过0.2%，含丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、甲基异丁基酮、甲苯和正丁醇均应符合规定； 采用面积归一化法对恩氟烷中的有关物质进行检查，按面积归一化计算，各杂质峰面积的和不得大于总峰面积的8.0%； 采用标准加入法对氨曲南中的残留溶剂进行检查，按标准加入法以峰面积计算，含乙醇不得超过2.0%，其他均应符合规定。

GC 由于气相色谱法的进样量一般仅数微升，为减小进样误差，尤其当采用手动进样时，由于留针时间和室温等对进样量也有影响，故宜采用内标法为宜；采用自动进样器时，也可采用外标法；采用顶空进样技术时，标准溶液加入法可消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。

二、光谱分析法 1.紫外分光光度法 杂质在某一波长处有最大吸收，而药物在此波长处无吸收。 肾上腺素中检查酮体。酮体在310nm波长处有最大吸收，而肾上腺素在此波长处无吸收。 酮体 取本品，加盐酸溶液（92000）制成每1ml中含2.0mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在310nm的波长处测定，吸收度不得过0.05。

A 260 280 300 320 肾上腺素（ ）中的肾上腺酮（ ）的检查

2.红外分光光度法 本法在杂质检查中主要用于药物中无效或低效晶型的检查。 某些多晶型药物由于其晶型结构不同，某些化学键的键长、键角等发生不同程度的变化，可导致红外吸收光谱中的某些特征带的频率、峰形和强度出现显著差异，其结果可靠，方法简便。 ChP检查甲苯咪唑中A晶型 有效C晶型 662cm-1较强吸收，640cm-1吸收很弱 无效A晶型 662cm-1吸收很弱，640cm-1较强吸收 结论：供试品在约640cm-1和662cm-1处的校正吸收值之比，不得大于含10% A晶型甲苯咪唑对照品在该波长处的校正吸收值之比。

典型文献研读 1.李华龙，米亚娴.紫外分光光度法测定复方电解质葡萄糖注射液(MG3、M3A、M3B、R2A、R4A)中的5-羟甲基糠醛.天津药学，2009,21（1）：18-20. 2.刘向红，宋宁宁，卢日刚，等.薄层色谱法测定青蒿素中有关物质.中国药师，2010,13（4）：583-584. 3.贺焕华，于 沛，黄克难.气相色谱法测定头孢吡肟中N-甲基吡咯烷杂质含量.中国抗生素杂志，2007,32（2）：87-88. 4.杨运云，袁莉莉，邓光伟，等.磺胺二甲嘧啶中4-氨基苯酚杂质的HPLC检测方法. 分析试验室，2009,28（6）：108-111. 5.金 薇，杨永健.高效毛细管电泳分离和测定注射用盐酸吉西他滨中有关物质.药物分析杂志，2004,24（5）：476-478. 6.吴永江，朱 炜，邵 青，等.高效液相色谱-质谱联用分析洛伐他丁中的杂质. 分析化学，34（1）：115-118.

复习思考题 1、杂质有哪些来源？ 2、如何计算杂质限量？ 3、氯化物检查的原理及注意事项？ 4、重金属检查的四种方法基本原理及适用范围？ 5、古蔡氏法检查砷盐的原理是什么？其中酸性氯化亚锡、碘化钾、醋酸铅棉花分别起什么作用？ 6、TLC用于特殊杂质检查主要有几种操作方式？其原理及各自的特点是什么？ 7、简述HPLC、GC检查特殊杂质的基本方法。