抗体工程研究进展 沈倍奋 军事医学科学院基础医学研究所

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治疗性抗体的研发阶段 靶标发现 抗体制备 抗体筛选、确认和优化 中试工艺研究 临床前研究 临床研究

主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他

靶抗原的发现

TRAIL: TNF-related apoptosis-induced ligand TRAILR: DR4、DR5、DcR1、DcR2、OPG

Proteomics Mass Control/Healthy Spectrometer Treated/Sick Protein extraction and digestion Peptides HPLC Mass Spectrometer Control/Healthy Treated/Sick Protein peptides KKYAAELHLV KAVQQPDGLA QFHFHWGSLDQPDGLA identification MS spectra quantification and MS/MS spectra Phosphorylation P Oxidation characterization O … post translational modifications (PTM)

功能单抗识别表位可能是一个新的药靶？ C5a新功能表位的确定 20a5-6 Light Chain 20a5-6 Heavy Chain 20a5-6 Fab 20a5-6 Fab/C5a 20a5-6 Heavy Chain

主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他

治疗性抗体产生抗－抗体的比例

抗体人源化的主要技术 嵌合抗体 CDR移植, FR移植, SDR移植 表面氨基酸残基人源化 抗原表位定向选择

嵌合抗体、CDR移植抗体

SDR人源化方法

表面氨基酸残基人源化 鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图

鼠源抗体/抗原作用的复合物模型 人源化抗体/抗原作用的复合物模型 人源化抗体识别的抗原表位与親本抗体相同

L H 高亲和力人抗体 抗原亲和筛选 + 人抗体轻链文库 人-鼠抗体库 鼠抗体 人抗体重链文库 抗原表位定向选择 L H

人源抗体制备技术 人х人杂交瘤技术 EB病毒转化技术 人源抗体库 噬菌体抗体库 合成抗体库 核糖体展示抗体库 转基因动物

大容量抗体库 >109 抗体亲和力 抗体库容 10-8~10-9 109 10-7~10-8 108~9 10-6~10-7 107~8 108~9 抗体亲和力 10-6~10-7 10-7~10-8 109 抗体库容 >109 10-8~10-9

合成抗体库

核糖体展示scFv文库

各种抗体库筛选方法

感染性筛选

抗原库对抗体库筛选方法

提高抗体特异性和亲和力 Chain shuffling 计算机模建技术 定点突变技术

chain shuffling 原理示意图 L H + L L L L H L H + L H H H H L H 亲本抗体 轻链文库 建抗体库 + L L L L H 亲和筛选 高亲和力抗体 L H 建抗体库 重链文库 + L H H H H 亲和筛选 chain shuffling 原理示意图 更高亲和力抗体 L H

计算机模建预测抗体亲和力和识别表位 HA2 HA4 HC4 H22 Z12 -378.2 -402.5 -435.6 -434.2 结合自由能 分子间氢键 识别区域 表位是否漂移 Z12 -378.2 -402.5 -435.6 -434.2 -431.6 18 21 28 38 34 20-32 23-30,70-89 76-92 136-147 140-146 是 否

抗体H22计算机分子设计与直接进化 抗体 分子间氢键 相互作用能（KJ） 主要识别区域 mCH22 38 -427.44 136-149 -425.37

抗体CH22m亲和常数测定 Items Antibody affinity Ka~ 6x1010L/mol B/F [S]-[B] (10-11M) Items Antibody affinity Z12 Ka=8×107M-1 1/750 CH22 Ka=9×109M-1 1/6.5 mCH22 Ka=6×1010M-1 1 Remicade® Ka=1×1010M-1 1/6

移植人免疫球蛋白的小鼠

抗体结构信息具有重要的研究价值

本地数据库 抗体分析系统主界面 抗体专家分析系统 抗体分类 PDBView 抗体结构分析 抗体序列分析 抗体表达分析 抗体分类管理 BLAST 系统日志管理 用户权限管理 Kabat 本地数据库 抗体分类 系统参数设置 系统字典设置 外部数据接口 PDB GENE BANK Swiss-Prot TRRD KABAT 本实验室抗体数据库 抗体分析系统主界面 抗体专家分析系统

Her2靶点人源抗体（HF)的设计与验证 抗原抗体复合物结构信息分析 人源化抗体设计、虚拟筛选 HF人源抗体基因合成、构建、表达 D4 SDS-PAGE非还原电泳 155KDa HF人源表达抗体的纯化和功能鉴定 HF人源抗体基因合成、构建、表达 人源化抗体设计、虚拟筛选 抗体专家分析系统 抗原抗体复合物结构信息分析 HF SKVO3 –Her2+++ MCF7 - Her2+ Herceptin HF人源抗体对Her2靶点的特异性识别 HF人源抗体对Her2+ +细胞的ADCC杀伤效应分析

新抗体或抗体类似物的设计 以抗原－抗体复合物的晶体结 构设计新抗体 以人抗体Fc为支架设计类抗体 以全人抗体为支架设计小抗体 以抗原－抗体复合物的晶体结 构设计新抗体 以人抗体Fc为支架设计类抗体 以全人抗体为支架设计小抗体 以非Ig的人蛋白为支架设计功能分子

拮抗肽－linker－Fc融合蛋白设计 PT4－Linker－FC融合蛋白的构象 PT4-Linker-FC与TNF-α相互作用复合物的构象

抗体可变区框架作为支架 VH结构域能够保持一定的刚性； VH在空间上能够将几个短肽展示在一定的区域内； 抗体可变区骨架展示的外源肽段长度可以改变。 CDR3 CDR1 CDR2 FR1 FR2 FR3 FR4

单域抗体（PTVH5）设计 PTVH5与TNF形成的复合物模型

单链抗体（TSA1、TSA2）设计 单域抗体 单链抗体(scFv)

主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他

提高抗体 效应功能 偶联细胞毒物质 双特异性抗体 抗体Fc突变 改变抗体糖基化 细胞内抗体 抗体融合蛋白

抗体药物的作用机理 直接效应 诱导凋亡 抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成 间接效应 依赖补体的细胞毒（CDC） 直接效应 诱导凋亡 抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成 间接效应 依赖补体的细胞毒（CDC） 依赖抗体的细胞毒（ADCC) 作为毒素、放射性同位素和细胞 毒药物的载体 形成抗独特型抗体 通过双特异性抗体靶向效应细胞

抗体偶联细胞毒物质

抗体融合蛋白

双功能抗体作用原理

（a), BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b), 连接的触发分子启动细胞毒反应；(c) , 效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。 抗HER2/neu×抗CD16 BsAb BsAb HER2/neu 膜表面分子 触发受体 CD16 NK细胞 效应细胞 肿瘤细胞 靶细胞 细胞毒反应 BsAb BsAb 双特异性抗体介导的杀伤作用机制 （a), BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b), 连接的触发分子启动细胞毒反应；(c) , 效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。

细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体 EGFR EGFR 细胞核 EGFR

抗体的ADCC和CDC效应

提高ADCC和CDC的策略 抗体Fc突变 改变抗体糖基化

Rituximab Fc的三维结构

Rituximab突变体与C1q的结合

主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他

提高表达量的方法 应用扩增系统 GS/DHFR 弱化选择标记基因 应用有利于基因表达的元件 位置效应（position effects) 强启动子 强增强子 反式作用元件 位置效应（position effects)

Cre-LoxP定点整合系统

‘Hotspot’-taged FRT 工程细胞株 可扩增 转录活性位点 lacZ-Zeocin bla pSV40△ FRT dhfr Genomic DNA Ori

抗体的糖基化

主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他

抗体可变区和框架区的影响 抗体稳定性 可溶性 折叠动力学 表达

PEG化的抗体或抗体片段

重组多克隆抗体

重组多克隆抗体 优点： 可大量生产，批间稳定性好 结合抗原的亲合力高 识别多个抗原表位，对复杂靶抗原的 治疗效果好 对于易变的抗原也能有效

谢谢