气相色谱-质谱联用技术 GC-MS Technology ——从理论到实践 ——From fundamental to application 杜玉海

质谱：我来自1887年

就回到过去 1887年4月30日，Joseph John Thomson勋爵在伦敦皇家研究院，“物 理科学周末大家谈”(Friday Evening Discourses in Physical Science)栏目 中，以一篇名为“阴极射线”的报告， 第一次报道了一种能对带电粒子进行测 量的仪器。Thomson勋爵因此获得 1906年诺贝尔物理学奖。

对！我只是摄谱仪！

第一台扇形场质谱 第一台扇形场质谱在1911年，由汤老爷 子在卡文迪许实验室的学生和同事 Francis William Aston实现。Aston也 因此获得了1922年诺贝尔化学奖。 Aston在1920年发表的The Constitution of Atmospheric Neon 也被认为是质谱应用的开端。

第一台真正意义的质谱仪 Arthur Jeffery Dempster 在芝加哥大学独立研制出了 单磁区方向聚焦型质谱计。 这台机器是第一台真正意义 的质谱计，成为了近代磁区 质谱仪器的原始模型。

此后的几十年 之后的十几年，质谱届就是这三个人的戏台，你方唱罢我登场。 1934年Dempster，Mattauch-Herzog和Bainbridge-Jordan 实现了第一台双聚焦质谱仪。 50年代，是质谱学高速发展的时期，双聚焦质量分析器得到进一 步发展，1953年出现了四级滤质器（Q），之后两年（1955年） 脉冲飞行时间分析器（TOF）也见诸报端。 1970s又出现了离子回旋共振（ICR）和四级离子阱（IT）。

1912 1st MS Thompson 1918 EI源，磁聚焦 Dempster 1919 使用质谱测定原子量 Aston 1936-1937 SIMS Arnot， Milligan 1946 飞行时间质谱仪(TOF) Stephens 1952 双聚焦仪器出现 Nier-Johnson 1953-1958 四级滤质器(Q) Paul等 1956 气质联用仪(GCMS) Gohike, McLafferty   高分辨质谱(HRMS) Beynon 1965 发现离子回旋共振ICR Hipple等 1966 化学电离源CI 出现 Munson, Field 1967 串联质谱 McLafferty, Jennings 1968 电喷雾源出现(ESI) Dole等 1969 场解吸(FD) Becky 1971 静电和磁区串联质谱(EB) Barber等

1974 大气压化学电离源 Horning等   等离子体解吸源 Mac Farlane等 FTICR质谱出现 Comisarow等 1981 快原子轰击质谱 Barber 1983 Thermospray 1984 Particle beam interface Willoughby, Browner ESI应用于大分子 1987 基质辅助激光解吸离子化（MALDI） Karas, Tanaka等 1989 ESI源应用于ICRMS Henry等 1990 ESI源被应用于观察蛋白质构成变化 Katta等 1991 Micro ESI Wilm

质谱仪的分类 一般而言，以质量分析器的种类作为质谱仪的分类标准。比如： 四级杆质谱仪，离子阱质谱仪，飞行时间质谱仪等等。 不过，也有其他的分类方式，比如……

三分法质谱：一般质谱

三分法质谱：文艺质谱 Ouyang, Z. and R. G. Cooks (2009). "Miniature mass spectrometers." Annual review of analytical chemistry 2: 187-214.

三分法质谱：2X质谱

质谱仪的一般结构 样品引入 产生离子 传输离子 过滤离子 检测器

离子源：产生离子 工作中的离子源 取出后的离子源

离子源的一般结构 出口透镜 离子透镜组 灯丝，离子源加热板 离子盒 永磁体和支架

电子轰击电离源（EI）：我最有力！ 电子轰击电离源（EI）是气质联用仪中应用最多的离子源。所有的气 质都配备EI源。通常电子流强度为50-250μA，改变灯丝和离子盒之 间的电位可以改变电子的能量。 当电子能量较小时，如7~14eV，离子盒内产生的离子主要是分子离 子。当加大电子能量如50~100eV，会部分产生断裂，成为碎片离子。 可以使用降低电子能量的方法来简化质谱图，但要注意电子能量太低， 电离效率也降低，产生的分子离子将会很少，使得检测灵敏度降低。 由于现有的标准电子轰击电离谱图（EI谱图）都是在70eV 电子能量 下得到的。因此在进行EI 谱库检索时，电离电压必须是70eV。 EI 源的特点是稳定，操作方便，电子流强度可精密控制，电离效率高， 所得的质谱图重现性好。但是EI 源要求被测试的有机样品必须是能够 气化的。有些化合物稳定性差，用EI 方式不易得到分子离子，因而也 就得不到分子量。

CI：温柔一击 CI 是利用反应气体（甲烷、异丁烷、氨等，而且反应气的量要比 样品气的量大得多）的离子和有机化合物样品的分子发生分子-离 子反应而生成样品分子的离子的一种“软”电离的方法。 对于负化学电离的优点有以下几点： 1）对于多数有机化合物来说有很强的分子量信息； 2）负CI 质谱图灵敏度要比其正CI 的质谱图高出2-3 个数量级。 （只对电负性强的离子反应，如CI，F 等；）因此对卤族化合物 的选择性很好； 3）可以用于分析复杂的混合物

离子透镜：让我牵引你走向彼岸

质量分析器传奇 质量分析器是质谱仪的核心，心脏部分。它将离子源产生的离子 按其质量和电荷比（m/z，m-离子的质量数，z-离子携带的电荷 数）的不同进行分离，得到按质荷比（m/z）排列而成的质谱图。 质量分析器的种类很多：有磁质量分析器，四级质量分析器（四 级滤质器），飞行时间质量分析器，离子阱质量分析器等。

质量分析器传奇——四级滤质器（Q）

质量分析器传奇——四级滤质器（Q） 安捷伦科技出品的597X系列质谱的石英双曲面镀金四级杆，597X是目前质谱届唯一需要加热的四级杆机器。

质量分析器传奇——四级滤质器（Q） 四级滤质器相对的两根为一组。 每组杆上都加上一组交流（称为 射频）和直流电（DC） 相邻的两根杆极性相反。 这样形成的电场，成为四级场。

质量分析器传奇——四级滤质器（Q） 四极场如图所示。

质量分析器传奇——四级滤质器（Q）

Scan vs SIM Scan SIM 一般扫描的范围比较宽，能 获得丰富的碎片信息。非常 适合于定性分析。 速度快，灵敏度高，非常适 合于复杂样品的定量分析。

质量分析器传奇——其它 除了四级杆滤质器以外，常见的还有下面的几种： （四级）离子阱（三维阱）：和四级杆原理几乎一致。采用两个 端盖和一个双曲面环实现。它可以储存离子，进而完成多级质谱。 线性离子阱（二维阱）：三维阱的四级杆版本 飞行时间（TOF）：将离子加速后，进入一段没有电场也没有磁 场的空间（漂移管）。离子飞行的时间和质核比的平方根相关。 扇形场（磁区）：最经典的实现 傅立叶变换离子回旋共振（FT-ICR）：将离子垂直注入一个磁场 中。不同质核比的离子所做洛伦兹运动的半径不同。通过傅立叶 变换，得到高分辨的质谱信号。 轨道阱（OribiTrap）：和FT-ICR同属于静电阱。但是它不需要 昂贵的液氮和液氦。

检测器 直接电检测器、电子倍增管、闪烁检测器和微通道板等 电子倍增器是最常用的检测器之一

气相色谱和气相色谱仪

气相色谱仪的结构 自动进样器 进样口 色谱柱 检测器

自动进样器——液体自动进样器

进样口

公平，有时候很难：进样口的分流歧视 分流歧视是指在一定分流比条件下，不同样品组分的分流比是不 同的，这就会造成进入色谱柱的样品组成不同于原来的样品组成， 从而影响定量分析的准确度。 不均匀汽化是分流歧视的主要原因之一。样品中各组分性质不同， 气化速度各不相同。尽量使样品快速汽化是消除分流歧视的重要 措施。使用合适的衬管也能在一定程度上消除分流歧视。 分流比的大小也会影响分流歧视。分流比越大，越有可能造成分 流歧视。 具体实践中，还要注意色谱柱的初始温度尽可能高一些。 色谱柱的安装的准确到位。 《气相色谱方法及应用》（刘虎威编著）

色谱柱 常见的色谱柱可以分为填充柱，毛细管柱两大类。毛细管柱因为 柱效高，已经成为主流。甚至在“永久气体”分离方面，也能够 替代填充柱。 毛细柱可以大体分为涂壁开管柱（WCOT）和PLOT柱，其中以 WCOT柱最为常用。

熔融石英管 聚亚酰胺保护层

常见的气相色谱柱和提供商 常见气相色谱柱： 常见提供商： 聚硅氧烷类色谱柱：-1，-5，-17，-35，-210，-1701，-624 聚乙二醇类色谱柱：-20M，-WAX，-InnoWax，-FFAP 特种色谱柱：环糊精键合手性柱 常见提供商： 安捷伦科技（Agilent J&W Varian）：多以HP，DB，VF开头 赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）：以TR，TG开头 岛津制作所（Shimadzu,Restek）：以Rtx开头 色谱科（Supelco）：很杂，什么开头的都用

如何选择合适的气相色谱柱 分离非极性物质，一般采用非极性固定液，此时各组分按沸点次 序先后流出色谱柱。 分离极性物质，选用极性固定液，此时试样中各组分按极性次序 先后出峰。极性小的物质先出峰。 分离混合物时，建议使用极性固定液，此时非极性组分先出峰， 极性组分后出峰。 分离样品性质不明的物质时，可先采用-5柱尝试。

色谱柱使用注意事项 在使用毛细管柱的过程中，主要是防止固定液流失，因为固定液 流失会使柱效能降低。事实上色谱柱固定液流失是自然的、热力 学平衡的过程。 切勿在使用中实际温度超过柱子的最高使用温度，一般要低于柱 子的最高使用温度20℃以下。 切勿在没有通载气的情况下使用柱子，防止固定液流失、氧化. 切勿随意用溶剂冲洗色谱柱，事先必须确认色谱柱是键合、交联 的固定相才可以冲洗，否则会严重损坏这一色谱柱。

质谱上常见的柱流失碎片 -1，-5，OV-101，SE-54：73, 147, 207, 221, 253, 281, 327, 355 -17：73, 147, 197, 221, 253, 281, 327, 355 FFAP,FFAB,Innowax:57, 69, 97, 123, 173, 191, 207, 219, 240, 264, 289 PEG:131, 133, 147, 161, 163, 191, 195, 205, 207, 281, 355

检测器 常用的气相色谱检测器有如下几种： 氢火焰离子化检测器（FID）：对有机物有很高的灵敏度 热导池检测器（TCD）：结构简单，灵敏度适宜，对所有物质都 有响应 电子捕获检测器（ECD）：对电负性物质有极高灵敏度 火焰光度检测器（FPD）：俗称“磷硫检测器”……

气相色谱和质谱联用技术 ——以Thermo Fisher DSQII气质联用仪为例

DSQ II能做什么？ 质量范围： 1 ~ 1050 amu 分辨率：单位质量分辨 扫描速度：最高10,000 amu/s 质量稳定度：0.1amu/12小时 灵敏度：（不分流进样1ul, 1pg/ul异辛烷溶液，RMS） EI＋ 1pg 八氟萘 全扫描 100:1 CI＋ 10pg 二苯酮 全扫描 10:1 CI－ 1pg 八氟萘 全扫描 1000:1 EI源 电子束校准磁场，具有最高的离子化效率 EI源能量可在0~130 eV间调节, 发射电流最高850 µA 独立加热控制，加热温度125°C～300°C 自动切换计算机控制正负化学电离源 通过更换离子盒进行EI源和CI源快速切换

Xcalibur：亚瑟王之剑 同安捷伦科技的Chemstation， 岛津制作所的GCMS Solution 不同，Xcalibur并不是实时控制型的软件。 这话怎么说？ 只要编辑好方法和序列，丢给Xcalibur即可，不用等待机器就绪或平 衡。Xcalibur会做好一切。甚至在提交序列给机器后，可以关闭 Xcalibur主程序。机器后台的守护进程会自动保存数据。 可以在运行当中追加序列或者删除序列中的样品。 程序模块化，可以通过增加相应模块的驱动实现对其它型号或其 它厂商机器的控制。比如，安捷伦1100系列HPLC，X890系列 GC，Waters，ShimadzuHPLC……

请看Roadmap.swf

你需要的，只是一个数据？ 还是正确的结果？ ——测样之前，请确认机器状态

上救生艇之前，请确保它不会沉 呃…… 你等等再来吧…… 一切安好

上救生艇之前，请确保它不会沉 做样之前，需要检查下面的几项内容： 做样后，请登记进样次数，以方便我们更换进样垫和衬管。 钢瓶气压力：我们使用双极压力表，请确保高压表压力高于2MPa 自动进样器：洗针液是否充足（应多于2/3），针芯是否拉动自如。 其它提示：管理员可能会在机器或者电脑上留下的任何注意事项。 做样后，请登记进样次数，以方便我们更换进样垫和衬管。 好的进样垫可以防止漏气，降低柱流失，提高重现性。 干净的衬管可以防止样品在进样口大量分解，避免出现鬼峰。 我们会根据大家登记的进样次数定期老化色谱柱，这对大家获取 正确合理的数据非常重要！

测试之前…… 1. 了解自己样品的性质，明确实验目的（定性？定量？） 2. 查阅文献，找到合适的分析方法。 3. 对机器的操作有所了解

第一个样品，第一个方法 样品制备 建立方法 创建序列 测试 查看结果 出具报告

测样前的准备工作 样品应可溶，可挥发，无任何机械杂质。 没有分离方法？没关系！我们准备了一台气相色谱供大家摸索分 析方法！ 甲醇？如果是-5这样的交联柱，也是可以接受的！ 乙醇？常用的无水乙醇仍然会含有可观量的水，这对色谱柱和质谱都 具有很坏的影响，不宜使用。 商品级的二氯甲烷通常还有一些盐酸，尽量重蒸后使用。 没有分离方法？没关系！我们准备了一台气相色谱供大家摸索分 析方法！ 实在没有办法的情况下，可以考虑衍生化。

创建一个方法 关于测试方法，应该设定的参数 气相色谱部分：包括进样口温度，柱箱升温程序，传输 线温度，He流速。 质谱部分：离子源温度，扫描的质核比范围，检测器增 益。 进样口和传输线温度应保证样品气化，He流速不宜过高， 否则对质谱部分真空不利。

请看Analysis Method.swf

创建一个序列：调用方法，测试样品！

请看seq.swf

气相色谱方法开发和优化 方法优化 提高灵敏度 增加样品量 减小膜厚 使用小柱径柱 延长保留时间 降低升温速率 降低流速 增加膜厚 更换固定相 增加柱长 提高分离度 换长柱，细柱 使用厚膜柱 缩短分离时间 提高升温速率 提高流速 使用短柱 升级机器

看结果！是什么？有多少？ Xcalibur的定性与定量

如何看？ QualBrowser提供Thermo全系列机器色谱质谱数据文件的查看， 处理，数据库建立，检索等功能。 一起来看看。

解谱之前，一些烦人的概念 原子质量 质量数 名义分子量

手动解谱初步：一般过程 1. 获得样品相关的其它数据：如化学性质，光谱，核磁，样品制 备方法。 2. 用正确的方法，获得一张有用的谱图。 3. 谱库检索和手动解谱。

手动解谱初步：天然同位素 元素 A A+1 A+2 类型 H 1 100 2 0.015 C 12 13 1.1 N 14 15 0.37 (±0.02） N 14 15 0.37 O 16 17 0.04 18 0.2 F 19 Si 28 29 5.1 30 3.4 P 31 S 32 33 0.8 34 4.4 Cl 35 37 32.5 Br 79 81 98 数据来自：McLafferty, F. W.《质谱解析》第三版

CCl4的质谱图

手动解谱初步：N规则 如果一个化合物含有偶数个氮原子，则其分子离子峰的质量将是 偶数。 这个规则不仅适用于分子离子，也适用于所有离子，因而可以表 述为：含有偶数个氮原子的奇电子离子，其质量数是偶数。

有多少？ 1. 样品制备 2. 色谱方法的开发 3. 标准曲线的建立 4. 样品分析 5. 复查结果 出具报告

标准曲线的本质 分析检测中的标准曲线是指一系列已知含量的物质与仪器 响应/信号之间的关系，数学处理就是曲线方程，图形表示 就是标准曲线。 标准曲线的核心问题要解决： 1、能找到确切浓度的标准物质或标准品。 2、标准系列和待测物质一定要有相同和一致的基体，因为样 品基体可能会干扰仪器的响应，从这个意义上讲，样品的前处 理实际就是提供标准和样品同样的基体环境，尽量祛除干扰基 体。所以最好的标准系列应该是样品基体匹配的标准系列。

标准曲线的本质

GBT22554基于标准样品的线性校准 1、标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围； 2、标准样品的组分尽量与被测样品组分一致； 3、标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围； 4、标准样品的个数至少应有3个浓度； 5、每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始；如果国 家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准， GB5750.3-2006 8.2.7项有如下规定：校准曲线相关系数只舍 不入，保留到小数点后出现非9的一位，如0.99989→0.9998。 如果小数点后都是9时，最多保留小数点后4位。

内标？外标？ 内标 外标 1.内标物应该是试样中不存 在的纯物质。 2.内标物应位于被测组分色 谱峰附近且与被测物完全分 离。 3.内标物与待测物理化性质 应该接近。 定量准确，但每次都要准确 称取试样和内标物，适宜于 快速控制分析。 将不同浓度的欲测纯物质分 别进样，然后绘制相应信号 和浓度之间的对应关系图。 分析试样时，取测得试样的 相应信号，由标准曲线可查 出其质量分数。 操作简单，计算方便，但结 果准确度取决于进样重现性 和操作条件的稳定性。

自动化：从繁琐的劳动中解脱出来！！ ——Xcalibur的自动化

开始之前：先做个报告模板吧！ 典型的报告中，通常包含下面的一些内容： 1. 页眉和页脚 2. 样品的一般性信息：包括样品信息，仪器方法 3. 样品的定性和定量信息。

请看rpt.swf

定性自动化： 自动化定性基于处理方法和定性报告模板。 定性处理方法主要是谱库检索。

请看Qualdemo.swf

定量自动化： 定量自动化包括方法设定，工作曲线绘制和报告输出几部分

请依次看quandemo.swf quandemo2.swf smpwithcal.swf

实际操作过程中，会遇到很多预想不到的问题，请务必联系值班助理或负责老师！！

谢谢！！！

问与答 Q&A

参考资料 Encyclopedia of analytical chemistry applications, Theory and instrumentation Edited by R.A. Meyers, Wiley Hoffmann, E. d. and V. Stroobant (2007). Mass Spectrometery Principles and Applications. West Sussex, John Wiley & Sons Ltd. Ekman, R., J. Silberring, et al., Eds. (2009). Mass Spectrometry Instrumentation, Interpretation, and Applications. WILEY-INTERSCIENCE SERIES IN MASS SPECTROMETRY. New Jersey, John Wiley & Sons. Rossi, D. T. and M. W. Sinz (2002). Mass spectrometry in drug discovery. New York, Marcel Dekker. Gross, M. L., G. Chen, et al. (2012). Protein and peptide mass spectrometry in drug discovery. Hoboken, N.J., Wiley McLafferty, F. W. (2011). "A century of progress in molecular mass spectrometry." Annual review of analytical chemistry 4: 1-22. Matthiesen, R. (2007). Mass spectrometry data analysis in proteomics. Totowa, N.J., Humana Press. Ouyang, Z. and R. G. Cooks (2009). "Miniature mass spectrometers." Annual review of analytical chemistry 2: 187-214.