基因扩增实验室技术验收流程 山东省临床检验中心 山东省立医院 王长印

CONTENTS 背景 基因扩增实验室设置 验收申请 验收流程 验收后实验室的管理

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PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow] 4

Kary Mullis 5

什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) 6

PCR及有关技术的发展历史（1） 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 --KB Mullis, Scientific American, april 1990 7

PCR及有关技术的发展历史（2） 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim) 1987 KB Mullis et al. ”Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335 8

PCR及有关技术的发展历史（3） 1987年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 1985年底成立的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989 Science (1988)报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的发现,预示着分子时代的到来。1989年12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断 。 RK Saiki, … KB Mullis et al. (1988) ”Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermo-stable DNA polymerase”, Science 239:487 9

PCR及有关技术的发展历史（4） 1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。 Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。 1991年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR专利权。 10

PCR及有关技术的发展历史（5） 1992 年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利； 1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR 标准试剂盒。 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 11

难忘的1995年-------被称之为PCR临床检验爆炸年？ 天下大乱！ 到天下大治！

1998.4.5《关于暂停临床基因扩增（PCR）检验的通知》，卫医发［1998］第9号 基因扩增技术是现代分子生物学检测的先进手段之一。开展PCR检验技术的医疗机构建实验室已有数百家，并在迅速扩展，有的甚至在乡镇卫生院开展。但是目前国内有上百家PCR试剂盒自行生产单位，至今尚未有一家获正式批准生产文号。试剂质量良莠不齐，加上实验室设置不规范，人员缺乏基本培训，造成临床检验结果的混乱，增加了患者负担，资源浪费严重。 　　经研究决定，各医疗机构不得使用未经正式批准的试剂开展临床PCR检验项目和发临床检验诊断报告。现阶段基因诊断检测只能用于科研，且不得以任何形式向患者收取费用。 　　请各地卫生行政部门将此通知精神及时转发各医疗机构，并要求认真遵照执行。

临床基因扩增检验实验室的设置 以前 目前 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号） 《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[2002]8号） 目前 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号 《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》

2011.3山东省卫生厅对卫生部《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 》进行了转发（鲁卫医字〔2011〕34号） ，并发布了《山东省临床基因扩增检验实验室技术审核办法 》，具体规定了技术审核流程。

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临床基因扩增检验实验室房屋设置标准

设施要求 试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。 必须严格控制临床基因扩增检验实验室的空气流向。 根据使用仪器的功能，区域可适当合并。 荧光定量PCR仪。 如果采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪 必须严格控制临床基因扩增检验实验室的空气流向。

设备要求 试剂储存和准备区 标本制备区 扩增区 扩增产物分析区 视所采用的方法来定。 冰箱、混匀器、微量加样器（覆盖0.2-1000µl）、可移动紫外灯、消耗品、专用工作服和工作鞋(套)、专用办公用品等。 标本制备区 冰箱、高速离心机、混匀器、水浴箱或加热模块、微量加样器（覆盖0.2-1000µl）、可移动紫外灯、生物安全柜等。 扩增区 核酸扩增仪、微量加样器、可移动紫外灯等 。 扩增产物分析区 视所采用的方法来定。

人员要求 实验室负责人 人员配备 上岗证培训 继续教育 第十四条 医疗机构临床基因扩增检验实验室人员应当经省级以上卫生行政部门指定机构技术培训合格后，方可从事临床基因扩增检验工作。 继续教育

技术人员要求 掌握实验室各项制度 掌握必要的专业理论知识 掌握技术操作 掌握质量控制知识 掌握实验室安全知识

根据所采用仪器的不同，设置2~4个区 试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区 如果采用荧光定量PCR仪 如果采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪

制度要求 建立完善的管理制度 建立健全质量体系文件

各区功能 试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。 标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。 扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。 扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。

临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行

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实验室建设完成，质量体系文件建立 填写《山东省临床基因扩增检验实验室技术审核申请书》 下载地址：山东省临床检验中心网站（www.sdccl.com.cn）资料下载栏目下，中心文件及申请表格 相关资料准备完毕后，寄送省卫生厅医政处。

省卫生厅医政处审核相关资料后，转交山东省临床检验中心。 山东省临床检验中心组织专家对申请开展临床基因扩增检验的医疗机构实验室进行初步技术审核，提出整改建议。 实验室进行整改后，试运行三个月 ，再由省检验中心派专家组进行技术审核。

需要提供的材料 医疗机构设置临床基因扩增检验实验室正式申请； 《医疗机构执业许可证》复印件； 拟设基因扩增检验实验室的设置平面图； 拟设置基因扩增检验实验室医院的医疗卫生资源状况、对临床基因扩增检验实验室的需求情况以及实验室运行的预测分析； 检验报告样单（2份）； 实验室技术审核相关表格； 实验室相关程序文件和标准操作程序（SOP）； 其它有关质量文件名称或证明材料。

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验收流程 申请 委托

验收工作程序 首次会议 技术验收 专家讨论 末次会议

技术验收内容 实验室设置和设备 设施和环境 人员 设备管理和质控物 检测方法 标本管理 记录 报告 质量控制 抱怨 等十章共三十七条

实验室设置和设备 本章共七条。 实验室分区：单一流向、明确的识别标记 各区仪器设备物品配备的充分性和科学性 必要的仪器设备、耗材、防护用品、办公用品等

实验室设置和设备检查重点 实验室的规范化分区及相应标识 仪器设备及在用标识 保持实验室空气流向的措施 各区物品的专用标识

设施和环境 本章包括五条； 实验室设施、工作区域、能源、照明等； 环境和实验条件控制设施：温湿度计、稳压电源等； 实验室进出的限制和控制； 实验室“内务管理”（如人员流动、清洁等）制度和相应设施； 化学试剂管理、废弃样本处理、生物防护等措施和相应设施

人 员 本章包括三条。 人员数量足够；必须经过培训，取得上岗证； 有培训计划和措施；继续教育计划和记录。 人员资格、培训、技能、业绩（论文、科研成果）档案。 健康档案

设备管理和质控物 本章包括三条。 所有设备应得到正确维护，应有设备维护程序文件； 加样器、温度计、扩增仪和酶标仪等设备应有明显标识表明其校准状态；定期校准 实验室应保存每一台仪器设备的档案材料，对档案材料的具体内容作了详细规定。

设备和质控物 每一台设备的档案内容包括：（1）设备名称；（2）制造商名称、型号、序号等；（3）接收日期和启用日期；（4）目前放置地点；（5）接收时的状态；（6）仪器使用说明书有复印件；（7）校准和/或检定的日期和结果及下次校准和/或检定的日期；（8）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；（9）损坏、故障、改装或修理的记录；（10）维修后校准方法、过程及记录。

检 测 方 法 本章包括三条。 标准操作程序（SOP）：仪器设备操作和校准程序；标本收集处理程序；扩增检测工作程序；仪器试剂的选购和质检程序；消耗性材料的购买、验收、质检和贮存程序等。 SOP应现行有效及便于使用。 对计算和数据换算应进行适当的校核。

标准操作程序（SOP） 是否具备申请表中列出的有关程序就可以了？ 是否实验室应准备的程序的名称必须与申请表中列出的程序完全一致？

标 本 管 理 本章包括五条。 建立唯一编号识别系统，避免标本混淆； 标本接收时的状态记录； 标本的适用性和充分性； 标本贮存的标准操作程序及贮存温度控制措施; 标本接收及安全处置程序； 维护实验室诚实性的必要措施。

记 录 本章包括三条。 有记录管理制度：适合自身实际情况，符合现行规章制度； 原始记录、计算和导出数据应归档并保存； 记 录 本章包括三条。 有记录管理制度：适合自身实际情况，符合现行规章制度； 原始记录、计算和导出数据应归档并保存； 校准和检测记录的重现性； 记录应有有关人员的签字； 所有记录和报告都要妥善保管并保密。

报 告 本章共四条 检测结果的报告应准确、清晰和客观； 报 告 本章共四条 检测结果的报告应准确、清晰和客观； 定性测定报告“阴性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ ml报告；避免二者之间的混淆； 每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发出日期、参考结果或范围； 如对报告有效性有疑问，实验室应立即通知临床相关科室予以改正； 用电话、传真、电子邮件报告结果时的保密原则。

报 告 通常报告存在的问题： 唯一标识、标本特性和状态、标本接收时间及报告时间、检测方法、校核人员签字

质 量 控 制 实验室应有室内质量控制标准操作程序； 实验室应参加室间质量评价。

室内质量控制 质量控制对于保证临床基因扩增检验质量来说是一项很重要的工作 室内质控是一个内涵非常丰富的工作，质控方法并不是一个确定的模式，多种多样，并且仍在不断发展，作为一个具体的实验室来说，应根据自己实验室的具体情况，制定一个室内质控程序文件，并按其进行室内质控

抱 怨 实验室应制定抱怨及其处理的SOP； 有关资料要归档； 抱 怨 实验室应制定抱怨及其处理的SOP； 有关资料要归档； 如抱怨涉及到工作是否符合现行程序，或是否符合管理办法和工作规范，或对实验室校准及检测质量有疑问时，则实验室应立即对这些范围的工作和有关职责进行审核。

其它有关技术验收表格 验收评审意见汇总表 整改要求 需要说明的其它问题

验收方式 看 审 问 测

实验室设置和设备检查重点 实验室的规范化分区及相应标识 仪器设备及在用标识 保持实验室空气流向的措施 各区物品的专用标识

文件审核 文件是否齐全 文件的可操作性 文件的现行有效

可移动紫外灯的操作SOP Why 消除或减少实验室核酸或扩增产物的污染。（目的） Who 具体的实验人员。（责任人） What 操作可移动紫外灯，用于实验台面、空间或仪器照射。（适用范围） When 每次试验后。 （适用范围） Where PCR实验室每区内。 （适用范围） How 如何打开可移动紫外灯、调节到距被照射物的距离（60-90CM）、照射多长时间等。（操作步骤）

现场提问或考试 工作人员对文件的熟悉程度 工作人员对一些问题的处理能力

现场实验 目的：考核实验室是否按所制定的规程进行常规检测，检测结果是否与预期相符只是其中之一。 方法：观察实验室从标本接收、编号、检测程序、检测过程中的记录、质控、结果判断、结果报告等是否按所制定程序进行。

验收中常见问题 文件不齐，无系统性 质量要素描述不全 格式不对 与实际工作脱节，缺乏可操作性 无现行有效性（无手签，各区无相应手册） 记录不全，不规范

关于实验室复审 审核质量体系文件的持续改进 记录的保存是否完整 仪器的校准是否及时 人员档案、仪器档案是否完整

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省卫生厅规定对通过技术审核临床基因扩增实验室每5年复核一次。 医疗机构在技术审核5年期满前的3个月内，向省卫生厅提出复核申请。 复审重点：看质量体系的持续改进、记录

关于实验室复审 审核质量体系文件的持续改进 记录的保存是否完整 仪器的校准是否及时 人员档案、仪器档案是否完整

质量管理体系的持续改进 持续改进是实验室为达到其质量方针和目标，致力于不断提高其有效性和效率的一个过程。包括 对已识别的改进项目确定新目标 调查可能的原因，通过数据分析找出关键的原因 为实现已确定的改进目标，研究、评价、确定改进的方案 实施所确定的改进方案 对改进的结果进行检查、验证和分析，证实并确认改进后的效果 将经证实有效的改进措施纳入相关文件，并对相关人员进行培训

制定编写计划

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