肿瘤侵袭转移研究进展及新世纪里的机遇与挑战 广东医学院病理学教研室 唐慰萍

1．人类对肿瘤生长与转移特性的认识 正常细胞转化为癌细胞必具备的六种能力 自身产生足够的生长信号 对抑制生长的信号失去敏感性 逃避凋亡调控机制 持续的血管再生能力 无限的自我复制 侵袭和转移

足够的生长信号 逃避凋亡调控 对抗生长信号不敏感 侵袭与转移 无限的复制能力 血管生成能力 正常细胞转化成癌细胞具有的六种能力

人类对肿瘤侵袭转移的认识 肿瘤是高度异质性的细胞群体 转移是一个多步骤、序惯的复杂过程 转移的发生是多因素相互作用的结果

2．具有不同转移潜能的癌细胞亚群的分离及转移动物模型的建立 转移细胞株筛选方法 体外筛选：有限稀释法等 CNE-2Z-H5,F1 体内筛选：裸鼠皮下-淋巴结转移灶循环或肺转移灶循环， 原位移植构建转移鼠模型等。

本实验室进行裸鼠体内筛选高转移癌株： CNE-2Z-H5 Nine times Spontanous metastasis Tissue culture Spontanous metastasis Nine times BALB/c nude mice CNE-2Z-H5

本实验室的工作： 已成功建立人鼻咽癌淋巴道转移模型 获得独具特色高低不同转移潜能的鼻咽癌细胞亚群CNE-2Z-H5和CNE-2Z-H5-9 鼻咽癌血道转移模型建立工作正在进行 该模型可作为药物筛选及抗转移治疗提供工具，也为进一步研究鼻咽癌基因表达调控谱提供材料。

鼻咽癌转移 裸鼠模型

3．癌细胞侵袭转移相关因素的细胞生物学研究 癌细胞电泳率观察： 体外电泳率高的癌细胞其体内侵袭转移能力强。 癌细胞粘附性研究： 高转移癌细胞株对内皮细胞及基底膜粘附率明显高于低转移细胞株；同时，高转移癌细胞株的自身粘附力降低 。

4．肿瘤侵袭转移过程中的基因调控变化 （1）癌基因与肿瘤侵袭转移 研究表明： 多种癌基因与转移相关， 如 Myc, Mos,Raf, Fos,Ras等

H-Ras gene 如： 小鼠T淋巴瘤细胞 BW5147(无侵袭转移力） 体内转移 体外侵袭 提示：H-Ras促进BW5147 侵袭转移 Transfection 小鼠T淋巴瘤细胞 BW5147(无侵袭转移力） 体内转移 体外侵袭 提示：H-Ras促进BW5147 侵袭转移

高转移鼻咽癌细胞株(CNE-2Z-H5-9)中： c-myc、c-erbB-2、bcl-2、TGFα、EGFR、PDGFR等癌基因产物表达增强

(2)、抑癌基因 目前已发现的抑癌基因近20多种，如Rb,P53,P15,P16,APC等。 实验证实： 高转移肺癌 细胞系PG P53mRNA 低于正常

(3) 转移相关基因和转移抑制基因 如转移相关基因:mta1 、Tiam-1 等 mta1 ：1989年从小鼠乳腺肉瘤细胞 中克隆，在转移癌细胞中高表达。 与食管癌、胃癌、直肠癌的侵袭 及淋巴结转移密切相关。 其它：CD44、MMP等基因

Tiam-1基因： 其它：CD44、MMP等基因 从小鼠T细胞淋巴瘤细胞中克隆出的转移相关基因。 Tiam-1蛋白能与CD44v、细胞骨架蛋白Amkyrin结合 。 参与细胞骨架的组织、细胞粘附、运动等过程。 其它：CD44、MMP等基因

转移抑制基因 nm-23 基因： 影响G蛋白的信号转导过程。 通过与NDPK相似途径参与细胞分化、信号转导的调控。 影响微管的聚合以调节细 胞运动。 影响G蛋白的信号转导过程。

在多数肿瘤中， nm23-H1表达水平与转移潜能呈负相关 与转移的关系： 在多数肿瘤中， nm23-H1表达水平与转移潜能呈负相关 常出现等位基因缺失，造成其蛋白功能异常 其它：如E-cadherin、KAI、Kiss、Maspin等基因

各种癌基因、抑癌基因在胃癌中表达情况： 我们的实验发现多种癌基因、抑癌基因、转移相关基因在各型胃癌原发灶及转移灶中的表达存在一定差异。

免疫组化检测各种癌基因在胃癌中的表达情况 nm-23-H1 p53

免疫组化检测各种癌基因在胃癌中的表达情况 Bcl-2 CD44v5

免疫组化检测各种癌基因在胃癌中的表达情况 CD44v6 E-CD

免疫组化检测各种癌基因在胃癌中的表达情况 PCNA p27

多基因蛋白表达与胃癌Lauren分型关系

PCR-SSCP检测p53,CD44v突变情况 P53突变 CD44v6突变

胃腺癌原发灶与相应淋巴结转移灶p53基因突变 分组 例数 P53(外显子5) 阳性(％) χ2 P值 原发灶 转移灶 22 4(18.2) 5(22.7)   0.14 >0.05 分组 例数 P53(外显子6) 阳性(％) χ2 P值 原发灶 转移灶 25 4(16.0) 7(28.0)   1.05 >0.05

胃腺癌原发灶和淋巴结转移灶中CD44v5和CD44v6基因的突变

5. 微环境改变与肿瘤侵袭转移 （1）蛋白水解酶在癌侵袭转移中的作用 丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活因子uPA、tPA、uPAR、PAI等； 金属蛋白酶类：如基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂 半胱氨酸蛋白酶类：如组织蛋白酶B，D等 弹性蛋白酶类

uPA、uPAR、PAI在不同转移潜能 鼻咽癌细胞株中的表达情况

uPA、uPAR、PAI在不同转移潜能 鼻咽癌细胞株中的表达情况

l uPAmRNA 246bp M CNE - 2Z H5 9 图1 uPA在鼻咽癌细胞中的表达

图2 各鼻咽癌细胞RT-PCR结果uPA mRNA与GAPDH mRNA灰度比值

图3 uPAR mRNA在鼻咽癌细胞中的表达

图4 各鼻咽癌细胞RT-PCR uPAR mRNA结果与GAPDH mRNA灰度比值

图5 PAI-1 mRNA在鼻咽癌细胞中的表达

图6 各鼻咽癌细胞RT-PCR结果PAI-1mRNA与GAPDHmRNA灰度比值

Western Blot检测 uPAR在CNE-2Z,H5,H5-9中的表达 60KD 55KD

此外，我们还发现低氧可以诱导PAI表达，但使u-PA,u-PAR表达下降

低氧诱导PAI-1表达 RT-PCR result ELISA result Normoxia (45.1±3.1)% Hypoxia (88.9±5.7)% Normoxia (6.15±1.38) ng/ml Hypoxia (8.92±2.33) ng/ml VEGF mRNA in hypoxic cells was (1.97±0.13)-fold (P<0.05) of that in normoxic cells. VEGF protein in hypoxic cells was (1.97±0.13)-fold (P<0.05) of that in normoxic cells.

低氧对u-PA表达的影响 RT-PCR result ELISA result Normoxia (43.7±4.7)% Hypoxia (39.0±6.2)% Normoxia (0.357±0.032)ng/mg Hypoxia (0.174±0.011)ng/mg * Normoxia Vs. Hypoxia (Independent Samples T-Test): u-PA, P>0.05( t=0.866) u-PA protein in culture medium reduced by (51.36±2.93)% in hypoxic cells (P<0.001)

基质金属蛋白酶(MMPs) 在鼻咽癌组织中的表达情况

免疫组化检测鼻咽癌组织中MMP-2,MMP-9,LMP-1的表达情况

MMP-9 MMP-2

（2）肿瘤血管生成与癌转移 肿瘤血管生成受多种促进血管生长因素和抑制血管生长因子的共同调控 淋巴管生成的研究正受关注

肿瘤血管生生成的调节 抑制因子 促进因子 纤维母细胞生长因子(bFGF) 干扰素(INF-α,β) 血管内皮细胞生长因子(VEGF) 转化生长因子(TGF) 转化生长因子(TGF- α) Endostatin TNF α Angiostatin PDEGF 血小板因子4 PA PAI MMPs TIMPs IL-8

低氧诱导VEGF mRNA表达 (RT-PCR) Isoforms Folds s VEGF189 2.67±0.30(P>0.05) VEGF165 2.05±0.03(P<0.01) VEGF145 2.73±0.15(P<0.05) VEGF121 1.65±0.01(P<0.05)

低氧诱导VEGF 蛋白表达 (Western-Blot) VEGF in hypoxic cells was (2.20±0.07)-fold of that in normoxic cells. *Independent Samples T-Test: t=8.944, P<0.05

6.信号转导与癌转移 各种癌基因、抑癌基因和转移调控基因的表达产物都参与某种信号转导过程. 癌侵袭转移过程中存在多条信号转导途径的紊乱 如Ras-Raf-MAPK通路 、FAK途径 NF-κB途径、AP-1途径和Wnt通路等

7．侵袭转移相关基因的克隆及功能研究 克隆与鉴定癌侵袭转移相关基因一直是肿瘤生物学家关注的最大热点。 基因克隆与鉴定技术进展迅速 如差异显示技术(DD-PCR)、代表性差异显示（RDA)、抑制消减杂交(SSH)及cDNA微阵列技术等。

我们实验室： 已初步构建高低不同转移潜能的鼻咽癌细胞株差异cDNA消减文库，并进行生物信息学分析

问题与展望： 转移各步骤和不同微环境中癌细胞基因表达谱变化尚难确定 各信号转导通路之间形成的交叉对话(Cross-talking)机制有待阐明 肿瘤临床诊断、疗效评价及预后判断的敏感标记物有待确定。 高通量技术平台的建立将为肿瘤转移研究带来新的希望

谢谢！