第八章 DNA的复制和修复 第一节 DNA的复制 第二节 DNA的损伤及修复

信息传递的中心法则 复制 DNA 转录 调控 逆转录 调控 蛋白质 RNA 翻译 复制

第一节 DNA的复制 一、 DNA复制的基本规律 二、 DNA复制中所需的酶和辅因子 三、原核生物的DNA复制过程

T4噬菌体DNA

一、DNA复制的基本规律

（一）DNA的复制方式——半保留复制 1、半保留复制概念：在DNA复制过程中，亲代的一个DNA双螺旋分子通过复制形成了两个与原先的碱基序列完全相同的子代DNA分子，每个子代分子中有一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。这样的复制方式，称为半保留复制。

2、DNA半保留复制的证据 15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度

（二）DNA复制的模式 复制子（replicon):基因组中能独立进行复制的单位。 起点（origin of replication ,ori):以一条链为模板，起始合成DNA的一段序列，富含A.T。 每个复制子都含有一个复制起点。 原核生物是单复制子，真核生物是多复制子 终点（terminus，ter）：与复制终止有关位点。 其中已发现Ecoli的复制终点含有23bp的保守序列，由tus蛋白与此位点结合参与复制的终止。 真核生物中似乎没有复制终止点

复制起点 83 33 复制终点 E.Coli基因结构和复制起止点

复制的方向：单向或双向 双向 单向

原核生物的θ复制：双向复制 复制叉

复制叉 起点 延伸 领头链 随后链 3’ 5’ θ形复制

三、 半不连续复制 半不连续复制—在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随从(滞后)链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。 不管是DNA还是RNA，核酸链的合成方向都是5’→3’ 前导链（领头链）：一条链以走向3’→5’的亲代链为模板，能连续合成，合成方向与复制叉移动方向同向，称为～。 滞后链（随从链）：另一条链以走向5’→3’的亲代链为模板时，只能按5’→3’的方向合成许多不连续的小片段（称为冈崎片段），最后再连成一条完整的子代DNA链。合成方向与复制叉移动方向相反，称为～.

3’ 5’ Rep蛋白 解链酶 SSB 前导链 滞后链

四、DNA复制中所需的酶和辅因子 模板DNA 前导链模板 解旋酶 引物 后滞链模板 DNpolymerase 连接酶 冈崎片段 新合成的 已连接的 单链结合蛋白 新合成的 前导链 DNA聚合酶

（一）、DNA聚合酶 1、在5’端有RNA（或DNA)存在的前提下，延长DNA子链 作用特点：不能从头合成子链，只能延长子链 （1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物； （2）反应需要有DNA模板的指导 （3）反应需要有引物3-OH存在； （4）DNA链的合成方向为5   3 ； （5）产物DNA的性质与模板相同 （6）DNA的体外聚合必须加入少量的DNA才能进行。

2、原核生物中的DNA聚合酶 E.COLi的DNA聚合酶 功 能 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 5’→3’聚合酶作用 + + + 功 能 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 5’→3’聚合酶作用 + + + 5’→3’外切酶作用 + － － 3’→5’外切酶作用　 + + + 聚合核苷酸数 /min 600 30 9000 分子数/细胞 400 100 10 *DNApolⅢ主要负责DNA链延伸。

DNA聚合酶的功能： 5’→3’聚合酶的活性催化dNTP加到DNA链的3’-OH末端（方向5’ →3’） 5’ →3’外切酶活性，作用于双链DNA的碱基配对部分，从5’端切下单核苷酸或寡核苷酸。在切除RNA引物中发挥作用。 3’ → 5’外切酶活性，作用于单链DNA3’末端核苷酸，能及时切除错配核苷酸,起校对功能，负责DNA的损伤修复

DNA聚合酶的5’→3’聚合酶的活性 P O H 5’ 5 3 + ¡ä ’ DNA 聚合酶 - α β γ PPi

3、真核生物的DNA聚合酶（DNA-pol）： 无

（二）引物酶 引物酶：此酶以DNA为模板合成一小段RNA。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 ⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 ⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5’→3’校对功能难发挥作用

（三）DNA连接酶(ligase，1967年发现） 作用： 催化双链DNA中一条链上缺口的共价连接，形成3’，5’-磷酸二酯键 条件： ①两片段相邻；②两片段需与同一互补链结合; ③反应耗能:细菌要求NAD+，动物和噬菌体要求ATP提供能量。

（四）DNA解螺旋酶（解链酶） 作用:通过水解ATP来断裂双链DNA互补碱基对之间的氢键，使DNA双螺旋分离形成复制叉 每解1个bp需耗2个ATP

（五）DNA拓扑异构酶 催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶。 作用：解开DNA超螺旋，改变连环数 螺旋 超螺旋

DNA拓扑异构酶改变连环数

拓扑异构酶Ⅰ 每次切断DNA双链中的一股和再连接 反应不需要能量。 主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶Ⅱ 可同时切断DNA双链，解旋或再螺旋后再连接.兼内切酶和连接酶活性。 需要能量（ATP或NAD+） 有ATP时可引入2个负超螺旋。引入负超螺旋可消除复制叉前进带来的张力，促进解链，同复制有关。

DNA拓扑异构酶Ⅱ的作用机制

（Single-strand binding protein, SSB）： （六）单链结合蛋白 （Single-strand binding protein, SSB）： 结合在已解开的DNA单链上 作用： ①保护单链DNA免遭核酸酶的降解，使单链DNA保持伸展态，以便作为模板。 ②降低DNA的Tm，促进DNA解链，阻止复性。

DNA复制酶 系一览

四.原核生物的DNA复制过程 1、复制的起始 原核生物从一个固定的起始点开始，同时向两个方向进行的双向复制——θ复制，复制起点都是富含A、T的区段。 大肠杆菌复制起点：oriC 终止点：ter 复制叉 终止区ter

E.coli复制起点oriC跨度为245bp，包含有三组串联重复序列和两对反向重复序列

起始过程： 一些特殊的蛋白可以识别并结合到复制起点，DNA环绕此复合物 使DNA双螺旋局部解链，在起始位点处形成复制眼、复制叉。 由引发合成酶合成引物。滞后链需不断合成冈崎片段的RNA引物 复制起点的识别 DNA解链 RNA引物的合成

大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质： DNaA 识别起点序列，在起点处打开双螺旋 DNaB 使DNA解旋 DNaC DNaB结合在原点所需 Hu 刺激起始 引物酶（DNaG） 合成RNA引物 SSB 结合单链DNA RNA聚合酶 促进DNaA活性 旋转酶（TOPOⅡ） 松驰DNA扭曲应力

2、DNA链的合成与延伸 前导链和滞后链的延伸同时进行。 子链延伸：引物合成后，在DNA聚合酶Ⅲ作用下，自RNA引物3’-OH末端依次添加与模板链对应互补的新的脱氧核苷酸。 半不连续合成： （1）前导链的延伸：连续合成，延伸方向与解链方向相同 （2）滞后链的合成：是分段进行的，延伸方向与解链方向相反。 不断合成冈崎片段的RNA引物，由DNA聚合酶Ⅲ按5’→3’的方向合成许多冈崎片段；当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3’-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。

3、复制终止 复制叉移动到终止区即停止复制： 切除引物，补齐缺口：由DNA聚合酶Ⅰ（5’→3’外切活性）催化，切去RNA引物；按碱基互补原则，沿5’→3’方向，留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ（5’→3’合成活性）催化合成一段DNA补齐缺口。 连接封口：由DNA连接酶催化，将补齐缺口的3’-OH基与下一个冈崎片段的5’-P以磷酸二酯键连接起来。 校正并修复DNA：由DNA聚合酶校正并切除错配，再按5’→3’方向加上正确核苷酸。以修复方式填补终止区50-100bp的空缺。

5’ 3’ 3’ 5’ 滞后链的合成 Pol Ⅲ 5’ 3’ DNA Pol I 5’ 3’ DNA 连接酶 5’ 3’ 5’ 3’

DNA复制时酶的作用次序： ⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。 ⑵ SSB结合于DNA单链。 复制叉前进时带来的扭曲张力。 ⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。 ⑸ DNA polⅢ在两条新生链上合成DNA。 ⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。 ⑺ DNA ligase连接两个冈崎片段。

五、真核细胞DNA的复制 1、真核生物中DNA的复制特点 真核生物染色体是线形的 有多复制子（多起点双向复制）。 真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。 真核生物在DNA复制的同时另外还要组装成核小体，组蛋白则是全保留的。 真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。

2、真核生物的端粒和端粒酶 DNA复制导致末端缩短 DNA聚合酶切除单链DNA 5’ 3’ 引物 引物 DNA聚合酶切除引物 5’ 3’

端粒(telomere) 是真核生物染色体线性DNA分子末端特殊的结构 ，富含GC的重复序列 人：(TTAGGG)n 端粒酶(telomerase) 催化端粒复制的一种核糖核蛋白，携带RNA模板（与端粒互补）的逆转录酶；既有模板，又有逆转录酶的作用 端粒结构 3 5  功能： ⑴保证线性DNA的完整复制 ⑵保护染色体末端 ⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。肿瘤细胞端粒酶活性恢复

端粒复制: 1）借本身RNA与末端ssDNA互补； 2）以酶上RNA为模板延伸ssDNA； 3）延长的ssDNA又可反折为引物，合成双链。

第二节 DNA的损伤及修复 一、 DNA的损伤： 破坏DNA的双螺旋结构，造成DNA结构和功能的破坏。 UV造成的基因改变 嘧啶二聚体的形成

互变异构：A＝NH时可形成A=C，G-OH时可形成GT三键配对 碱基脱氨：C-U，A-I，G-X 二、 DNA的损伤原因： 自发性损伤 复制时的碱基错配 互变异构：A＝NH时可形成A=C，G-OH时可形成GT三键配对 碱基脱氨：C-U，A-I，G-X 碱基丢失：大肠杆菌每代丢失一个嘌呤，哺乳动物可达一万个。嘧啶丢失几率只有嘌呤的1∕20。

环境作用引起的损伤： 诱变因素及突变类型

三、 损伤的修复 直接修复 切除修复 重组修复 诱导修复 细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上的损伤，恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有4种酶修复系统： 直接修复 切除修复 重组修复 诱导修复

1、直接修复 （1）光复活修复： 可见光激活了光复活酶，它能分开由于UV照射形成的TT（CC CT）嘧啶二聚体，而恢复原来状态。

紫外线损伤的光复活过程：A 形成嘧啶二聚体，B. 光复合酶结合于损伤部位， C 酶被可见光激活，D. 修复后释放酶 光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢复正常。 光修复酶的激活需300-600μm波长的光。 光修复酶广泛存在，对单细胞生物比较重要，但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞，且是次要修复方式。

（2）O6-甲基鸟嘌呤的修复 甲基化的鸟嘌呤在甲基转移酶的作用下，将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上

2、切除修复： 在一系列酶作用下， 将DNA受损部分切 掉，并以完整链为模 板，合成出被切部分， 从而使DNA恢复正

I、结构缺陷的核苷酸切除修复： （1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。 （2）核酸外切酶切除损伤的DNA。 （3）DNA聚合酶修复。 （4）DNA连接酶连接。

II、碱基切除修复 DNA糖苷酶可识别不正常的碱基，水解下不正常的碱基，形成AP（无嘌呤无嘧啶）位点 对于AP位点的损伤的修复方法： 核酸外切酶切除， DNA聚合酶修复， DNA连接酶连接。

3、重组修复 当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。（发生在复制后）

4、诱导修复 DNA严重损伤能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。 倾向差错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。是在DNA损伤面太大，复制难以继续的情况下发生。特异性很低。

本章要求 1、掌握生物学中心法则、半保留复制，不连续复制、逆转录酶的概念。 2、掌握DNA聚合酶催化的反应，复制保真性依赖的机理。