第十二章 产物的提取与精制

第一节 概论 一、下游加工过程在发酵工程中的地位 1，下游加工过程的定义 第一节 概论 一、下游加工过程在发酵工程中的地位 1，下游加工过程的定义 发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。它由一些化学工程的单元操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。

2，地位 传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部份占整个工厂投资费用的60%。 对重组DNA发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的80%~90%。

二、发酵下游加工过程的特点 培养液(或发酵液)是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。 培养液中所欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高，特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质蛋白质。 另一个特点是欲提取的生物物质通常很不稳定、遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。 发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性。

四、发酵工业下游技术的一般工艺过程 下游加工过程由各种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作，理论比较成熟，而另一些则为新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两者之间的有离子交换过程等。

1， 一般工艺过程 一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离；初步纯化(提取)；高度纯化(精制)；成品加工。

2，工艺过程的划分： 预处理和固液分离 ：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。 初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件 高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。 成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决定。

3，选择下游加工工艺的原则： 是胞内产物还是胞外产物 原料中产物和主要杂质浓度 产物和主要杂质的物理化学特性及差异 产品用途和质量标准 产品的市场价格 废液的处理方法等

分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)； 除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 第二节 发酵液预处理和固液分离 目 的 分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)； 除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。

一、 发酵液的预处理 采用理化方法设法增大悬浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。 去除会影响后续提取的高价无机离子。

预处理的方法 1，高价无机离子的去除方法 2，杂蛋白质的去除 3，发酵液的凝聚和絮凝

镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。 1，高价无机离子的去除方法 钙离子，如用草酸沉淀。 镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。 铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。 草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液(也称为原液)质量。但草酸价格较贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60C下反应生成草酸铅。后者在90~95。C下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。

2，杂蛋白质的去除方法 热变性 沉淀 大幅度改变pH

3，发酵液的凝聚和絮凝 机 理 电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使伦敦·范德华(London—Vander waals)吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。 方 法 在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。 常用的絮凝剂 聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠 凝聚和絮凝的概念，过去常常混淆，现已趋于明确区分开来。凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量

二、 发酵液的过滤 微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。

1，影响过滤速度的因素 过滤速度和以下因素有关 菌种。 发酵条件 培养基的组成 未用完培养基的数量 消沫油 发酵周期

菌种对过滤速度影响 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。 细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。

培养基的组成对过滤速度影响 用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难； 发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。

发酵周期对过滤的影响 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。

过滤助剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。 过滤助剂可解决两个问题 常用的过滤助剂 滤饼的可压缩性问题 小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题 常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉

3，固—液分离设备的选择 不同性状约发酵液应选择不同的固—液分离设备。常用于发酵液的分离设备有： 板框压滤机 鼓式真空过滤机 离心沉降分离机

板框压滤机 优点： 缺点 板框压滤机的过滤面积大； 过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差； 结构简单，价格低， 动力消耗少等优点。 缺点 不能连续操作，设备笨重，劳动强度大， 卫生条件差， 非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。 板框压滤机的过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适应性强，同时还具有结构简单，价格低，动力消耗少等优点，因此，目前，国内广泛被采用。但是，这种设备不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长(包括卸框、卸饼、洗滤饼，洗滤布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。自动板框过滤机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。对于菌体较细小，粘度较大的发酵液，可加入助滤剂或采用絮凝等方法预处理后进行压滤。对于难过滤的枯草杆菌发酵液，可设计一种特别薄的板框以减小滤饼的阻力。另外，也可采用带有橡皮隔膜的压滤机，过滤结束时，在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来压榨滤饼，将液体挤压出来。

鼓式真空过滤机 优点 缺点 能连续操作， 能实现自动化控制 压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。 鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。例如，过滤青霉素发酵液的速度可达800L／(m2.h)。而对菌体较细或粘稠的发酵液不太适用。一种较好的解决办法是过滤前在转鼓面上预铺一层助滤剂，操作时，用一把缓慢向鼓面移动的刮刀将滤饼连同极薄的一层助滤剂一起刮去，这样使过滤面积不断更新，以维持正常的过滤速度。放线菌发酵液可采用这种方式过滤。

离心分离 优点 分离速度快，效率高， 操作时卫生条件好等优点， 适合于大规模的分离过程。 缺点 投资费用高， 能耗较大。

三、微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。 还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液， 对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。

4，微生物细胞的破碎技术 机械方法 非机械方法 球磨机 高压匀浆器 X-press法 超声波破碎 酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法

破碎方法的选择 选择合适的破碎方法需要考虑下列因素： 细胞的数量； 所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性； 要达到的破碎程度及破碎所必要的速度， 尽可能采用最温和的方法； 具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。

第三节 沉淀法 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。 沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。

根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： 盐析法； 等电点沉淀法； 有机溶剂沉淀法； 非离子型聚合物沉淀法； 聚电解质沉淀法； 高价金属离子沉淀法。

一、盐析法 盐析：在蛋白质溶液中加入中性盐使其沉淀析出的过程。 机 理 破坏蛋白质分子表面水膜 中和蛋白质分子表面水膜

1，盐析法的优点 2，盐析法的缺点 成本低，不需要什么特别昂贵的设备。 操作简单，安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 沉淀物中含有大量的盐析剂

3，盐析用中性盐的选择 常用的中性盐 MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4 选择中性盐应注意的问题 使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而本身又易去除。 对酶无毒性，应用不受影响。 价格低廉。 废水处理容易。

二、有机溶剂沉淀 原 理 有机溶剂的沉淀作用主要是降低水溶液的介电常数，溶液的介电常数减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加从而使溶解度减少。 优 点 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易。 在生化制备中应用比盐析法广泛 缺 点 容易引起蛋白质变性失活，操作常需在低温下进行。且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。

1，常用的有机溶剂 乙醇 甲醇 丙酮 异丙醇

2，有机溶剂的选择 有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质种类及有机溶剂的种类而异。对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂沉淀能力，依次为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度的影响。丙酮沉淀能力最强，但挥发损失多，价格相对较高，工业上一般采用乙醇。

三、等电点沉淀法 等电点沉淀法主要利用两性分子上的电中性时溶解度最低，而各种两性分子具有不同等电点而进行分离的一种方法。 两性分子在处于等电点时的pH值，再加上其他沉淀因素，则很易沉淀析出。

等电点沉淀法的优缺点 优点：很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，井且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。 缺点：酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。

在发酵工业的下游加工过程中，吸附法应用于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生素的提纯精制。 第四节 吸附法 在发酵工业的下游加工过程中，吸附法应用于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生素的提纯精制。 应用选择性吸附法分离精制的产品包括： 蛋白质 核酸 酶 抗生素 氨基酸

一、吸附法的原理 吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用。

二、吸附的目的 将产品吸附浓缩于吸附剂上； 将杂质、色素等需要从发酵液中去除的物质吸附于吸附剂上。

三、吸附法的优缺点 优点： 缺点： 由于凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂的应用，克服了以上缺点，近年吸附法又得到重视。 可不用或少用有机溶剂； 操作简便、安全、设备简单； 生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。 缺点： 吸附法选择性差、收率不高。 无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大。 炭粉等吸附剂影响环境卫生。 由于凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂的应用，克服了以上缺点，近年吸附法又得到重视。

四、吸附的类型 物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附。 化学吸附： 化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力 范围。 交换吸附： 吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。

五、吸附剂的基本要求 吸附剂要求颗粒密度小，表面积大，但孔隙也不能太多，否则被吸附物质不易被洗脱。 吸附剂的颗粒大小要均匀。 吸附剂的吸附能力要大，但不能影响洗脱。

六、吸附剂的种类 疏水或非极性吸附剂（活性炭） 亲水或极性吸附剂（硅胶、氧化铝） 离子交换树脂吸附剂

第五节 离子交换法 离子交换作用：是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。 蛋白质、氨基酸、核酸、酶、抗生素。

两性离子交换剂 选择性离子交换剂 吸附树脂 电子交换树脂

四、离子交换的操作方式 分批法 固定床法 流动床法

第六节 膜分离过程 1748年法国学者Abbe Nollet首次提出了膜分离现象，经过近二个世纪的摸索、研究，20世纪50年代膜分离技术才逐渐发展成为一门新兴高技术边缘学科。 1963年第一个膜渗析器的诞生开创了膜分离技术的新纪元，二、三十年来得到了迅猛的发展，在各个工业领域及科研中得到大规模应用，出现了各种有价值的微滤、超滤、纳滤和反渗透等分离膜 。

膜分离技术的优点 适用范围广； 膜分离过程为物理过程，不需加入化学药剂； 膜分离技术分离装置简单，占地面积小，系统集成容易 ； 膜分离过程系统简单、操作容易，且易控制，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。

一、膜分离方法的分类 透析 超滤 反渗透 微滤 电渗析 液膜技术 气体渗透 渗透蒸发

膜过滤的孔径范围

二、表征膜性能的参数 孔的性质(包括孔径、孔分布和孔隙度) 水通量 截留率的截断分子量 抗压能力 pH适用范围 对热和溶剂的稳定性。

三、膜分离设备 1，选择膜分离设备应考虑以下因素： 分离类型 生产量 操作时的应变性 保养难易程度 操作方便与否

2，常用的膜分离设备 管式过滤器 内压式 外压式

中空式过滤器 中空纤维膜组件 用粗的中空纤维膜组装成用于超过滤的膜组件，它具有类似于单管程管壳式换热器的结构。所用的中空纤维，在内壁或内、外壁形成表层。内压式膜组件适合于管内流过料液，管间汇集渗滤波，外压式膜组件相反，管间走料液，管内汇集渗滤液。

螺旋卷式过滤器 卷式膜组件是用平面膜卷制而成的。将两张超过滤膜叠在一起，表层各自向外，在三条边上相互粘合，形成一长信封式的膜袋，在此袋内插入一张挠性的多孔薄板。用一管壁钻有许多小孔、两端带有连接件的管子，作为膜组件的中心管。先将伸出膜袋口外的多孔薄板卷绕中心管一圈，再将膜袋开口粘合。然后将一隔网叠在膜袋上，一起卷绕在中心管上，形成螺旋卷，最后将外缘封固。

平板式过滤器 板式膜组件用平面膜组成。用它所组装的超过滤器在结构上与压滤机相近，而差别有二：其一是压滤机有料液进口和滤液出口，须拆卸机体才能取出滤饼；而超过滤器内不生成滤饼，设备不需经常拆卸，除了料液进口、渗滤液出口外，还须有滤余液出口。其二是超过滤器须迫使料液作高速流动以减轻浓度极化的影响，而压滤机无此要求。因之，在设备内超过滤用串联流道，压滤用并联流道。 板式膜组件用平面膜组成。用它所组装的超过滤器在结构上与压滤机相近，而差别有二：其一是压滤机有料液进口和滤液出口，须拆卸机体才能取出滤饼；而超过滤器内不生成滤饼，设备不需经常拆卸，除了料液进口、渗滤液出口外，还须有滤余液出口。其二是超过滤器须迫使料液作高速流动以减轻浓度极化的影响，而压滤机无此要求。因之，在设备内超过滤用串联流道，压滤用并联流道。

各种膜分离设备性能的比较

四、操作特性 浓差极化：当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，因而便膜面浓度增大，并高于主体中浓度这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中，这种现象称为浓差极化。 凝胶层：当膜面浓度增大时，通量降低。当膜面浓度增大到某一值时，溶质成最紧密排列，或析出形成凝胶层。 浓差极化示意图 凝胶层的形成

为了减少浓差极化的发生，膜过滤一般采用的错流过滤方式。错流过滤是一种新的过滤方式与常规过滤的区别在于它的固体悬浮液流动方向与过滤介质平行，而常规过滤则是垂直的，因此，能连续清除过滤介质表面的滞留物，使滤饼不能形成，所以整个过滤中能保持较高的滤速。 Cross-Flow Filtration

微滤（MF）膜、超滤（UF）膜、纳滤（NF）膜、反渗透（RO）膜 五、膜分离过程在发酵工业中的应用 微滤（MF）膜、超滤（UF）膜、纳滤（NF）膜、反渗透（RO）膜

第七节 萃取 溶剂萃取法是20世纪40年代兴起的一项化工分离技术，它是用一种溶剂将产物自另一种溶剂(如水)中提取出来，达到浓缩和提纯的目的。 溶剂萃取法比化学沉淀法分离程度高，比离子交换法选择性好，传质快，比蒸馏法能耗低且生产能力大，周期短，便于连续操作、容易实现自动化等。

新型的萃取技术 双（两）水相萃取 反相胶束（胶团）萃取 超临界萃取 液膜萃取

5，全醪液分离技术 用萃取法提取发酵产品时 ,原位全醪液分离工艺 ,可以大大提高效率 ,降低成本。但是利用传统的有机溶剂萃取工艺就存在困难 ,如乳化现象 ,而且普遍需要萃取、反萃取反复操作才能结晶成为产品。采用双水相技术就可以避免乳化 ,直接从醪液中提取。细胞、细胞碎片和培养基中的不溶物对分配行为没有显著的影响 ,所以不同批次的发酵液可以取得几乎相同的结果。而且细胞和产物分离在两相 ,避免了胞内的降解酶类对产物的破坏作用。

赖氨酸分离提取

1、请简述发酵染菌的原因有哪些？染菌后主要采取哪些挽救措施。 发酵工程设备作业六 1、请简述发酵染菌的原因有哪些？染菌后主要采取哪些挽救措施。 2、发酵过程染菌的检测通常使用哪些方法？生产中如何合理的使用这些检测方法判断是否染菌。 3、发酵生产下游加工过程有什么特点? 简述一般下游加工工艺过程。 4、请简述胞内产物和胞外产物下游分离纯化工艺的异同。

5、画出两级冷却、两级分离、适当加热空气除菌流程框图以及高效前置过滤除菌流程图，并在框内标出设备名称。 6、请画出通气搅拌发酵罐示意图，并简述主要组成设备功能和作用。