第六章 DNA 序列多态性 人类基因组DNA序列差异是个体间最本质的差异。 (sequence polymorphism)。 同一个体不同组织、器官的细胞中基 因组DNA序列一致，是法医学个体识别鉴定的基本前提。

DNA 序列多态性常用检测技术： 1）序列测定 2）斑点杂交技术 3）PCR-RFLP技术 4）序列特异性PCR技术 5）其他：SSCP, MVR-PCR 新技术：DNA芯片技术 DHPLC技术 MALDI-TOF-MS技术

DNA 序列测定 DNA序列测定(DNA sequencing) 是对 DNA分子一级结构的分析。从多态性的概念分 析，序列测定的靶位点碱基种类，实质是SNP：在 特定的染色体、特定的靶位点上，不同个体、不同 等位基因的碱基种类。 一、双脱氧核苷酸 链终止法测定原理 经典的核酸序列测定方法有： Sanger 双脱氧核苷酸链终止法 Maxam化学降解法

DNA复制的基本条件： ▲单链DNA模板 ▲DNA聚合酶 ▲寡核苷酸引物 ▲dNTP合成原料 基本过程： 1）引物与模板退火形成双链区。 2）DNA聚合酶结合并启动引物延伸。 3）dNTP按照碱基配对原则逐个连接在引物的3’端，以5’→3’方向延伸合成一与模板互补的DNA新生链。

1.DNA聚合酶与模板结合，在模板链上移动方向：由模板的3’→5’；引物延伸方向是5’→3’。 2.dNTP按照碱基配对原则，连接在引物3’末端。 3.新合成链碱基与模板对应碱基间以氢键连接；连接引物末端与新连接的碱基之间是磷酸二酯键。

磷酸酯键 连接

2’-d-脱氧核糖 2’，3’dd-双脱氧核糖

在DNA合成体系中如果加入2’，3’-ddNTP，当ddNTP按照碱基互补原则连接到引物3’端，该最后一个碱基没有3’-OH ，无法连接后续的dNTP，使该引物链终止在这个碱基位置上，不再延伸。 由于反应体系中还加有dNTP，与ddNTP形成竞争状态。引物末端连接有dNTP者，可以继续延伸。最后DNA合成的产物是一系列具有不同ddNTP终端的新合成DNA链。 例如，在反应体系中加dCTP和ddCTP：

设置一套四组反应体系：A，T，G，C： 每组除正常反应需要的dNTP外，分别加入：ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP。 复制产物经过电泳后，直接银染显带，或采用同位素标记放射性自显影，或者四组引物分别用4种荧光染料标记。 经过DNA合成反应后，由ddNTP终止的不同长度的新生DNA片段。然后分四泳道分离。检测被终止DNA片段长度并确定碱基种类，可以直接读出DNA序列。

自动循环测序技术： 利用PCR技术，以靶片段为测序模板，反应体系中同时加入有dNTP和ddNTP，PCR产物是不同长度的被终止片段。 标记方式：多采用：Dye-terminators。如果4种ddNTP分别 标记不同的荧光： (例如：A-绿、C-红、G-蓝、T-黄) 荧光染料基团标记的 基本特点： ▲激光诱发吸收光谱在可见光范围。 ▲不影响引物延伸反应。 ▲不影响标记后DNA片段的电泳性质。 ▲4种荧光的吸收和激发波长有足够的差异。

四组反应安排在同一管中进行。循环测序只需要一条引物，模板DNA以线性方式扩增，引物延伸分子以不同碱基对应位置终止的片段。 电泳技术的检测灵敏度要求高，必须能够区分相差一个碱基对的DNA片段。 毛细管电泳自动检测目前是常规检测技术 读序原则与依据： ▲荧光波长（颜色)，判定引物链终止在哪一种核苷酸， ▲由DNA片段电泳通过激光检测窗口的即时时间判定片段长度。 从电泳图谱可以直接读出模板的碱基序列。

二 等位基因特异性探针杂交技术 Allelic specific oligonucleotide (PCR-ASO) 杂交的定义与条件

法医学应用：HLA-DQA1基因座和PM系统。 ▲等位基因特异性探针杂交技术原理： 依据序列等位基因的序列差异，设计针对不同等位基因的DNA探针，并标记有示踪物。与样本DNA扩增产物杂交，有杂交信号，证实样本个体具有相应的等位基因。 ▲基本步骤：1）PCR扩增 2）杂交 3）杂交信号显示 法医学应用：HLA-DQA1基因座和PM系统。

反向斑点杂交(reverse blot hybridization):

固定载体膜上的 探针， 可以呈点状（点印迹 dot blot）； 也可以呈线条状（线条状印迹 line blot)。

1. HLA-DQA l 基因座 (旧称HLA-DQα) 反向斑点杂交检测HLA-DQα是法医学应用最早的PCR技术序列多态性分型技术。 已确定的HLA-DQAl基因座可表达的等位基因有12个，反向杂交法用11个寡核苷酸探针可区分其中的8种等位基因： HLA-DQαl.1、1.2、1.3、2、3、4.1、4.2和4.3。 反向杂交技术商品试剂盒主要检测的是前6个常见等位基因。

Polymarker system: 包括：低密度脂蛋白受体，血型糖蛋白A，血红蛋白Gr球蛋白，D7S8，型特异性成分等 5 基因座。

PM系统同步检测5个基因座，个体识别能力达到0.99以上。 不同人群基因频率分布见表6-3 (p154)。 ASO杂交技术 优点： ▲分型操作简单，结果判定容易。 ▲无须电泳，避免片段长度检测误差。 ▲重复性好。 ▲灵敏度和特异性好。 技术 缺陷：信息量低。价格因素。

原理：依据等位基因碱基序列差异，选择适当的限制酶，对等位基因PCR产物作RFLP分析，可以区别不同的等位基因。 (注意与DNA指纹RFLP的区别)

谷丙转氨酶(GPT)基因-RFLP分型 GPT基因定位8q24. 3，基因跨距2 谷丙转氨酶(GPT)基因-RFLP分型 GPT基因定位8q24.3，基因跨距2.7kb。基因有11个外显子。 GPT多态性由第1外显子密码子14出现一个点突变：C304A。 等位基因 *1序列：CATG （Nla III) *2序列：AATG

1 PCR：GPT基因扩增引物（产物长 163bp)： 5’-CCTTCCCGCCTGGTCTGGGT-3’ 5’-AGCTCCAAGGCTCGCTGCAC-3’ 限制酶消化： Nla III 消化， GPT 1-1型：67，40，31，25bp GPT 2-1型：71，67，40，31，25bp GPT 2-2型：71，67，25bp

PCR-RFLP分析技术特点： ▲技术简单，分型结果容易判定。 ▲电泳后图谱无须准确确定片段长度。 ▲重复性好，灵敏度高。 问题： ▲ 单就某个基因座而言，等位基因数有限，多态性程度不高。 ▲ 不是所有点突变都能利用RFLP技术检测，只有涉及到限制酶识别点时才能够采用RFLP分析，观察发现：基因组DNA中的点突变，大约只有 1/3 与限制酶识别点有关。 ▲ 酶切条件要求严格，影响到可重复性。 ▲ 不能解决混合斑迹的个体识别问题。

PCR-RFLP技术简单实用、成本低，广泛地应用在点突变检测。 Rousselet(1998)总结人mtDNA-D环1100bp中有88个突变点，其中只有21个可以采用RFLP技术检测，HV-I区段18个，HV-II区段中有3个。 法医生物学检材的特殊性，以及RFLP分析的酶切条件要求十分严格，影响了检测结果的可重复性。多态性程度不如序列多态性检测。 mtDNA序列变异的RFLP分析实际应用受限。

（sequence specific primer-PCR) 根据等位基因碱基序列设计 ‘等位基因特异性引物’， 例：Gc基因定位：4q11-13，编码区长度1377bp，编码485个氨基酸。 变异位于11号外显子 416密码子G1248T； 420密码子A1259C。

PCR反应特异性的关键因素在于引物3’末端碱基与模板的匹配，控制引物链能否顺利退火和延伸。

五 PCR-SSCP 技术 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism ,SSCP) 在正常情况下，双链DNA凝胶电泳的迁移率主要与分子量有关。而单链DNA在非变性PAG中，迁移率不仅与分子量有关，而且与单链分子的构象也有关。单链分子的构象主要与碱基构成有关，相同长度的单链DNA，因内在碱基组成不同，甚至单个碱基差异，可以形成不同的空间构象，出现迁移率的差异。最终表现成SSCP电泳图谱的差异。

PCR-SSCP技术简单，检测灵敏度高。多用于单个碱基突变形成DNA序列多态性的筛选。 （2）扩增产物96℃变性10m，立即冰浴3min。 （3）T6%C3% PAG加样电泳。 （4）银染显带（或扩增产物标记显示）。

HLA-Cw-PCR-SSCP分型

mtDNA-PCR-SSCP

PCR-SSCP技术的优点： 1）操作简单，无须复杂的专业设备。 2）试验周期短，可用于大量样本的排查。 3）可以通过标识物或者银染显带，成本低。 4）检测灵敏度较高，无假阳性结果。 缺陷： 1）可以发现点突变，但不能确定碱基位置，须要进一步测序。 2）迁移率与分子构型相关，不能确定片段的准确长度。 3）无法标准化命名。 4）可重复性问题。信息量问题。

六 MVR-PCR技术 1） D1S8（MS32）小卫星，重复单位29bp。串联重复单位碱基组成不是一成不变。大约有一半的重复单位内含A-G替换，构成一个Hae III识别点(-GGCC-)。称为： Microsatellite variant repeat mapping, MVR。 2）能被Hae III识别的重复单位称a型；不能被Hae III识别的称t型。 3) 针对A/G设计特异性引物： 32-TAG-A和32-TAG-G， 上游的公共引物为：32D。 4）电泳：

5）显带 6）判型数字编码（含Hae III点为A;不含Hae III为T)： ①A＋;T－为1型； ②A－;T＋为2型； ③A＋;T＋为3型。记录2个体的前40个重复单位： A: 11223 21311 21332 12123 12122 12312 13112 11122 B: 21112 12311 13221 11121 13221 13213 11231 22113 对200名汉族人群调查，统计前40个重复单位，没有发现相同的个体，计算平均匹配概率为10-15。 D1S8(MS32)小卫星理论上有240个重复单位。理论计算可以鉴别2241=3×1072种等位基因。

(single nucleotide polymorphism, SNP) 单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 特点： 1 基因组中含量丰富，按1/1000碱基突变率计算，SNP估计有300万座位。 2 从本质上反映出个体差异，群体结构差异的标记系统。 3 信息量大，同步检测50-100个SNP，可以达到15个STR基因座的信息量。 4 二等位基因系统，利于信息数据化，利于自动检测。 5 检测SNP的PCR产物长度在100bp左右，利于降解DNA的分析检测。也利于复合扩增体系建立。

SNP基因座选择基本条件： 1 数据库中候选SNP，必须经过群体调查证实是随机人群中存在的二态遗传标记，并出现在主要人群中。 2 等位基因频率其中一个在0.5~0.7 （DP值在0.625~0.580），有足够的多态性。 3 突变率低。 4 SNP基序列不存在串联重复结构，GC含量平衡。 5 SNP附近不能有容易突变的碱基，有利于引物设计。 6 遗传连锁问题。SNP间距大于1000kb为基本要求。

所有的DNA序列分析技术理论上都可以利用来检测SNP。 突破点在于多基因座同步检测，达到一次检测可以获取大量的遗传信息，才有实用价值。 新技术： 1. DNA芯片技术 2. DHPLC技术 3. MALDI-TOF-MS技术

生物芯片技术 (DNA chip) 基本原理是DNA分子杂交。 靶SNP的PCR扩增片段与固定在膜上的探针杂交。根据杂交阳性或阴性，以不同标记荧光波长呈现，在激光共聚焦显微镜下收集信号并判读，由计算机记录和处理。

技术为DNA chip提供强大的技术支撑。‘微 缩芯片实验室’的技术设想。 法医学DNA分析技术的新领域 技术优势： ▲ 巨大的信息量。在同一时间和条件下，快速获取样本SNP信息。 ▲ 高度专一性和敏感性。可靠并准确检测 出10pg/µl的DNA样本。 ▲ 高度的可重复性。尼龙膜探针阵列可重 复应用。 ▲ 微型化与自动化。微加工技术、计算机 技术为DNA chip提供强大的技术支撑。‘微 缩芯片实验室’的技术设想。 法医学DNA分析技术的新领域 （目前存在问题）

基质辅助激光解析电离/飞行时间 质谱技术（MALDI-TOF-MS） 基本原理：样本分子分散在基质分子中形成晶体。用激光→晶体，基质吸收能量→样本分子解吸附→电离样本分子在电场的作用下→飞过检测真空管→依据到达检测器的飞行时间不同→测到分子质量差异→获得序列差异信息(m/z)。

MALDI-TOF-MS技术检测SNP实例 检测apoE SNP(334T/C位点） 1.样本基因组DNA提取。 2.PCR扩增靶片段，产物纯化。 3.特异性单碱基延伸反应，产物纯化。 4.样本TOF-MS分析，计算引物峰与样本峰 之间的m/z之差，推断SNP(334T/C位点） 的碱基种类。 技术优势: 高灵敏度，高信息量

变性高效液相色谱技术(TmHPLC) 基本原理：

生物芯片、MALDI-TOF-MS、DHPLC等均是解决多SNP座位同步检测的前沿技术。目前开发的还有焦磷酸测序技术、微测序技术、实时荧光定量PCR技术等。但是从目前的研究看，它们存在问题主要是法医物证检材的特殊性造成的。 2004年，欧洲法医科学中心(ENFSI)DNA工作组、美国DNA分析方法科学工作组(SWGDAM)联合评估结论： 未来很多年内，SNP不太可能取代STR作为法医科学样本的参考检测方法。