生物芯片技术及其发展

生物芯片的定义 生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。 生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。 1998年世界十大科技突破之一。 未来十年最具发展潜力的技术。

特点 高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。 多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。 微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。 自动化：降低成本，保证质量。

生物芯片分类 尚未统一。 广义上：矩阵型芯片、处理型芯片 固化材料：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片

研究历史 1991 Affymatrix公司Stephen Fodor:光刻与光化学技术、 多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNA Chip概念 Stanford大学Brown实验室：预先合成，机械手阵列 1995 Schena等：基因表达谱 1996 Chee et al：DNA测序 1996 Cronin et al：突变检测 1996 Sapolsley & Lipshutz：基因图克隆 1996 Shalon et al：复杂DNA样本分析 1996 Shoemaker et al：缺省突变定量表型分析

分类（根据应用） 基因变异检测芯片 表达谱芯片 疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌) 法医鉴定(如DNA指纹图谱) 肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异) 药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异) 发育(同一组织不同发育时期基因表达差异) 组织发生(不同组织或器官的基因表达差异)

分类（根据工艺和载体） 原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。 DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。

分类（根据DNA成分） 寡聚核苷酸或DNA片段：约2025个核苷酸碱基，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）。 全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。

基因芯片的种类 Science Chip：生物分析和诊断。 Nutri Chip：食物分析、转基因、污染检测。 Leuko Chip：血液分析、病毒分析、HLA分析。 Aqua Chip：水质分析。 Secure Chip：含DNA的物质鉴定。 Chromo Chip：基因分析和染色体序列。 Prokaryo Chip：原核生物、兽医、环保等。

生物芯片技术主要环节 芯片制备：微点阵 样本制备：DNA提纯、扩增、标记 杂交：样本与互补模板形成双链 检测：共聚焦扫描，双色激光 数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。 结果

生物芯片分析 1、测定过程应包括五个基本步骤： 需解决的生物学问题 样本制备 生物化学反应 检测 数据分析

2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。 3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。 4、所有基因分析必须平行处理。 5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。 6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。 7、检测系统必须能精确地获得数据。 8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。

9、两种或以上平行数据组比较应受到单 个实验所固有特性的限制。 10、绝对比例关系只存在于组合实验的平 行数据组内。 11、平行格式包括内在和外部的整个系统 误差的分析因素。 12、在每个系统模块中采集到该系统所有 变量的四维数据时，才能称为完成生 物系统平行基因分析。

生物芯片技术的12条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可参见 http://cmgm. stanford 生物芯片技术的12条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可参见 http://cmgm.stanford.edu/~schena/ http://www.technologymentors.com/

芯片制备 原位合成法（in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。 合成后交联（post-synthetic attachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。

两种制备方法比较 原位合成：测序、查明点突变 合成后交联：比较分析 高密度、根据已知的DNA编制程序 制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化， 交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯片。 中、低密度，样品浪费较多且制备前需储存大量样品。

杂交 是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步 液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。 选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。 合适长度的DNA有利于与探针杂交。 温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。 最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。

样本制备 制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。 用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。 样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。

结果分析 芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据： 共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。 质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。 化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。

芯片扫读装置 根据采用的光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。 根据激光光源，可分为激光型和非激光型。 应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。

图象分析 复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。 分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。 图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。

质量控制 实验对照： 体外转录从cDNA合成mRNA，参入标本中作为对照。此mRNA不与点阵的核酸杂交。 将不同浓度的不同基因参入标本中，可作为标本间标准化的参照。 用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本，如果两种荧光强度一致，可排除标本间变异因素。 用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂交。

结果有效性的证实 在表达矩阵上，有时难于区分极其相似的序列，如基因族成员，亚类或异类的存在。 比较两种不同DNA序列表达水平时，有些参数如核苷酸的成分、二级结构的存在和矩阵上DNA的长度都会影响杂交。 证实矩阵分析的结果可用RT-PCR(区别基因族成员,比较不同DNA种系表达,证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平)、Northern Blot(证实某一基因的相对表达水平)、Western Blot(RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。

生物芯片技术的应用 基因表达分析：肿瘤 基因突变检测：遗传性疾病 测序、基因图绘制和多态性分析：测序 微生物菌种鉴定：毒力基因、抗药基因 药物研究：新药筛选、指导合理用药 克隆选择及文库筛选

生物芯片技术的发展 发展趋势 微型化：DNA矩阵越来越小。 集成化：矩阵上的基因组越来越大。 多样化：测定范围越来越广。 微量化：测定所需样本越来越少。 全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。 定量化：如激光捕获技术，显微解剖技术等可精确测定一个细胞内的一个基因的表达。 DNA矩阵数据信息库的完善。

生物芯片技术的发展 技术 毛细管电泳芯片技术 PCR芯片技术(PCR-Chip) 缩微芯片实验室(lab-on-a-chip) 微珠芯片技术(beadArray) 抗体和蛋白质阵列技术(Antibody and protein-array technology) 自我定制芯片技术（make your own chip) 血气分析芯片

毛细管电泳芯片技术 Mathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在10分钟内完成了对433个碱基序列的测定。 宾夕法尼亚大学Wilding等成功地利用毛细管电泳芯片分离了用于诊断杜鑫-贝克肌萎缩的多条DNA片段。 瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸的分离。

缩微芯片实验室 在一张芯片上完成样品(如血液、组织等)制备、化学反应、检测和数据分析。 1998年程京博士首次应用LOC实现了从样品制备到反应结果显示的全部过程，成果地从混有大肠杆菌的血清中分离出了细菌。 含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经问世。也已出现样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片。 LOC与卫星传输和网络生物信息学结合，将实现高通量、一体化和移动性的“未来型掌上实验室”的构想。

抗体和蛋白质阵列技术 蛋白质组学(protiomics)的兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术的发展。 Pareick Brown使用特异性抗体微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋白质。 Leuking等采用蛋白质微阵列技术，测定了10pg的微量蛋白质，并证实假阳性极低。

乳腺癌基因芯片

Stanford 乳腺癌微矩阵(Perou et al.1999) 每种基因的数据以行表示，每个实验用列表示。 颜色强度表示对照和实验cDNA的比率。比率相同时为1。 结果为红色表示mRNA增加，绿色表示减少，灰白色表示缺乏。 两种基因的相似性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算。

DNA微矩阵分析软组织肉瘤表达 Kavine Maillard et al(1999) cDNAs进行DNA表达矩阵，PCR产物包被在经赖氨酸处理的玻片上，用Cys3-和Cys5-标记的cDNA进行杂交，洗涤后用Scanarray3000扫描仪测定矩阵，表达数据储存在ACeDB数据库中，根据数据表达类型区分不同的基因。

微矩阵分析DNA和蛋白表达 Holger Eickhoff et al.(1999) 根据已有的序列数据，组合800000人类EST序列，已重矩阵了38000克隆用于RNA表达分析，克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定19200个基因片段，标记人组织RNAs与被选的38000人基因片段的矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织的图象，用软件分析点识别和点定量。 使用寡聚核苷酸鉴定新的cDNA克隆，和进入表达载体，使相应蛋白能直接表达，矩阵后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的关系。

生物芯片相关仪器 点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。 杂交仪：全自动完成调节、加探针、漂洗和热循环的杂交过程。 扫描仪：激光共聚焦或CCD直接成像分析结果。

微矩阵仪器介绍 Q Bot Q Pix Q Array Q Pet Q Soft 2000

Q Bot 超高解析基因筛选暨排列分析仪。 基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h 基因排列打点(Gridding)：100000/h 基因复制(Replication)：9696,96384 基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘 基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片 全自动液体分注系统(Liquid Handling):96针，注液量1200l，适合PCR产物。 分析软件：分析、质控、上网。 环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板

Q Pix 半敞开式基因筛选暨排列分析仪(经济型) 基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h 基因排列打点(Gridding)：100000/h 基因复制(Replication)：9696,96384 基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘 基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片 分析软件：分析、质控、上网 环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板

Q Array 第三代半敞开式基因微矩阵排列仪。 基因微矩阵排列(Microarrying)：同时处理84片玻片，每一打点玻片分4个区域，可安排不同的矩阵排列。可选16或24针座。 仪器容量：玻片84片，玻片架6个，384孔板5盘。 分析软件：分析、质控、上网。 环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板。

自动液体处理系统。

杂交仪 Affymetrix 640杂交仪： 温度范围：0100C 探针用量：l 流速： 10ml/min 样本区： 2.46.4cm

扫描仪 GenearrayTM扫描仪： 激光：氩离子,488nm 适用染料：荧光素、藻红素 单扫描时间：<4分钟 分辨率：3、6、9或24微米