乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测 缪晓辉 2009.5

一、HBV耐药的有关定义 二、各种耐药检测技术的评价 三、需要重视的几个问题

一、HBV耐药的有关定义 病毒学突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化学突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐药（genotypic resistance） HBV表型耐药（phenotypic resistance） 临床耐药（clinical resistance）

HBV耐药的有关定义 病毒学突破（virologic breakthrough） 指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。

HBV耐药的有关定义 病毒反跳（viral rebound） 指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。

HBV耐药的有关定义 生化学突破（biochemical breakthrough） 指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。

HBV耐药的有关定义 HBV基因型耐药（genotypic resistance） 指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。

HBV耐药的有关定义 HBV表型耐药（phenotypic resistance） 通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。 通常以IC50来评估 IC50＜5倍:敏感 IC50在5～10倍:部分耐药 IC50 ＞10倍:耐药

HBV耐药的有关定义 临床耐药（clinical resistance） 指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。

二、各种耐药检测技术及评价 病毒学反跳或突破的监测 HBV基因型耐药监测 HBV表型耐药检测 临床耐药监测

病毒学反跳或突破的监测 基于对血清HBV DNA载量的动态监测 需重视以下三点： 1. HBV DNA载量检测手段的敏感性 2.检测技术的可靠性和稳定性 3.监测的间隔时间

HBV基因型耐药监测 时机 非必须 不主张常规、广泛应用

基因型耐药相关变异的命名

基因型耐药相关变异 在HBV多聚酶序列中的位置

HBV基因型耐药的主要技术 碱基序列分析法 直接测序 克隆测序 聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 反向杂交分析技术（INNO—LiPA） 基因芯片技术 实时荧光定量PCR技术 探针定点突变PCR技术 引物末端碱基定点突变扩增技术 熔解曲线法 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)

直接测序法 末端终止法 化学裂解法 DNA测序自动化 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 优点 简便、迅速、应用广泛。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 ①简便、快速、准确可靠。 ②安全、无放射性污染。 ③模板用量大大减少。 ④测序能力增强。

HBV YMDD变异直接测序结果图谱

直接DNA测序的局限性 1. 设备贵、技术高、耗材、费时。 2.必须有充足目的基因片段。 3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBV YMDD变异1.JPG

克隆测序法 将待测标本进行PCR扩增后，将扩增片段插入克隆载体进行基因重组，再将重组子导入感受态细菌中。将细菌在平皿上进行涂布、培养，利用克隆载体上的标记筛选出有含有插入目的片段的多个阳性菌落，分别进行增菌，抽提出各个克隆中的质粒后，再进行基因测序。

克隆测序法 优点： 1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株 之间的相对比。 2.提高了检测的灵敏度。 局限性： 1.技术难度较高。 2.检测周期更长。 3.检测的费用大大增加。

聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 碱基变异可能导致： ① 原有位点消失 ② 产生新的位点 ③ 识别位点移位 利用错配引物使 PCR产物中产生 特异的酶切位点 结果: 酶切片段长、短变化和多、少变化

Nla Ill限制酶的识别序列和切割位点： 限制性内切核酸酶的作用 它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如： Nde I限制酶的识别序列和切割位点： ---CA TATG--- ---GTAT AC--- Nla Ill限制酶的识别序列和切割位点： ---CATG NNN--- ---GTAC NNN---

PCR-RFLP检测HBV YMDD变异 错配引物设计 PCR

PCR-RFLP检测HBV YMDD变异

PCR-RFLP检测HBV YMDD变异

PCR-RFLP技术的评价 优点： 简单、广泛易开展。 缺点： 1.限制性内切酶种类有限。 2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。 3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测 敏感的下降。

反向杂交分析技术（INNO—LiPA） INNO-LiPA 法是一种反向分子杂交的方法,预先将多个特异性探针包埋在硝酸纤维素膜上,再与变性的DNA 片段反向杂交,然后显色,最后根据探针特异核苷酸确定待测DNA片段的核苷酸序列。

INNO—LiPA诊断HBV YMDD变异

DNA芯片技术 “Hybridize” Microarray fabrication Sample preparation Biological Sample arrayer “Hybridize” Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis 又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarray)。 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。 Scanner Analyze data

DNA芯片技术诊断HBV YMDD变异 Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.

DNA芯片技术 优点 局限性 大通量 技术和设备的要求高 快速 检测成本高 灵敏度高 可平行检测

实时荧光定量PCR在基因变异中的应用 探针定点突变PCR技术-----Taqman-MGB探针 引物末端碱基定点突变扩增技术 高分辨熔解曲线法

Taqman-MGB探针定点突变PCR技术

Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异 当病毒载量较高（HBV DNA>105copies/ml）时， 弱势株与野毒株比例相差不大时，优势株与弱势基本等效扩增，随着比例的不平衡的加剧，竞争抑制也越明显，当模板W:M=10:1时，检测结果显示W:M≌45:1，与实际情况相差较大。当病毒载量较低时（HBV DNA<105copies/ml），弱势株可能被完全抑制。 HBV DNA>105copies/ml W:M=1:1 HBV DNA>105copies/ml W:M=10:1 HBV DNA<105copies/ml W:M=10:1 ：W ：M

探针定点突变PCR技术 优点 不足 灵敏度高 需要相对较贵的荧光PCR仪 特异性好 需要多条荧光探针，成本高 优点 不足 灵敏度高 需要相对较贵的荧光PCR仪 特异性好 需要多条荧光探针，成本高 费时短 影响因素多，存在一定误判

引物末端碱基定点突变扩增技术

引物末端碱基定点突变扩增技术 检测YMDD变异 随着变异毒株在总病毒量中的比例逐渐增加，ΔCti-c及ΔCtv-c值也逐渐减小，检测结果基本反应了各模板的实际比例。

熔解曲线法检测YMDD变异 特异性探针，其Tm值不同 溶解曲线分析

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理 脉冲激光照射到基质与样品混合物，基质吸收能量而爆炸，导致样品离子化。离子化的分子在强电场的作用下被加速，获得动能，然后沿飞行管无场区飞行。离子的质量与其飞行时间的平方成正比。故可通过测量离子在管中的飞行时间来求其分子量。

MALDI-TOF MS检测 HBV YMDD变异的原理 在YMDD区上游引入一酶切位点，使得PCR产物可被酶切成片段，因其分子量不同，可被MALDI-TOF MS检测到。 酶切分子量.JPG

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS) 优点： 高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于1%的变异株。 局限性： 设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。

HBV耐药不同检测技术的比较 1Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a test’s ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined. Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-16

HBV表型耐药检测 有两种途径： 1.细胞外HBV聚合酶活性分析。 2.细胞药物敏感性实验。

细胞外HBV聚合酶活性分析 目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达HBV颗粒，应用亲和层析法纯化HBV颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。

细胞外HBV聚合酶活性分析

细胞药物敏感性实验 该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含HBV变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的HBV DNA含量。

细胞药物敏感性实验

细胞药物敏感性实验 该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。

临床耐药监测 YMDD变异前后病毒载量和ALT的变化

HBV MDD变异与病毒学突破 在拉米夫定治疗过程中， YMDD变异株一直存在。尽管出现YMDD变异意味着病毒学突破的可能性增加，但是少量YMDD变异株的存在不足以预示病毒学突破。当YMDD变异株的比例大于野毒株的5倍时，病毒学突破的风险大为增加。

判断临床耐药时的建议 1. 结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是否合并其他肝病等。 2.注意甄别依从性不良。 3.结合基因变异位点。

三、需要重视的几个问题 慎重对待天然耐药的结论。 不要过分依基因型耐药检测技术。 正确对待基因分型技术。

YMDD自然变异的几组数据 Akarsu M等采用InnoLipa 法检测71例未经抗病毒的成年慢性乙肝携带者，结果有13例检测到YMDD变异株。 Lee CZ等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对28例拉米夫定治疗前的CHB患者血清进行了YMDD变异毒株检测，发现有16例（57.1%）存在YMDD自然变异毒株。 日本Kobayashi等检测18例无症状HBV携带者,发现5例YMDD变异,占27.78%。

本实验室关于YMDD自然变异 的2组数据 VS 183例CHB患者中，检出存在YMDD突变毒株者共40例，检出率为21.86%。其中YVDD阳性36例，YIDD阳性3例，YVDD和YIDD同时阳性者1例。 196例CHB患者中，检出存在YMDD变异毒株者共21例，检出率为10.7%。其中YVDD阳性20例，YIDD阳性1例，YVDD和YIDD同时阳性者0例。 VS

不要过分依基因型耐药检测技术 基因型耐药变异并非必须。 目前我国尚无SFDA批准的商品化试剂盒或被普遍认可的检测技术。

正确对待HBV基因型 与核苷类似物疗效之间的关系 基因型是一种人为的分类方式。 HBV的基因型与各种核苷类药物的疗效之间的关系还没有确定的结论。 P区基因的变异对S区基因的影响。

结语 加深认识 适时监测 及时发现 正确管理

谢谢！