三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组 微生物学实验 Lab work on Microbiology 三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组 实验指导老师：涂 璇

实验九、环境因素对微生物的影响 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料 四、实验步骤 五、实验任务 六、实验报告

一、实验目的 了解常用化学消毒剂、抗生素、紫外线及温度对微生物的作用 观察各因素对微生物生长抑制的强弱

二、实验原理 1.化学因素 环境当中很多化学因素都可以影响微生物的生长。 ①酸类（PH值） H+影响菌体细胞质膜上电荷性质，微生物吸收物质变化，影响代谢，高浓度H+或引起菌体表而蛋白质和核酸水解以及影响酶和活性；

②碱类：引起蛋白质、核酸水解，破坏酶的活性； ③重金属盐类：引起蛋白质失活；或与代谢产物鳌合作用使其变为无效化合物； ④氧化剂：氧化蛋白质活性基团； ⑤有机化合物：对微生物有杀菌作用的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性，是常用的杀菌剂。

2、抗生素（生物因素） 自然界中普遍存在微生物间的拮抗现象，许多微生物可以产生抗生素，能选择性地抑制或杀死其他微生物。 不同抗生素的抗菌谱是不同的，如青霉素和多粘菌素分别作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，属于窄谱抗生素；四环素和土霉素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有作用，属于广谱抗生素。 利用滤纸条法可初步测定抗生素的抗菌谱。

3.物理因素 紫外线：作用于生物体DNA，紫外线照射后受损的细胞，如果立即暴露在可见光下，则有一部分仍可恢复正常活力； 温度：通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构入细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度。

三、实验材料 1、菌种 大肠杆菌、枯草芽孢菌 2、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 1、菌种 大肠杆菌、枯草芽孢菌 2、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 3、溶液及试剂 2.5%碘酒，5%石炭酸，70%乙醇，新洁尔灭，无菌生理盐水 4、器材 无菌培养皿，无菌滤纸片，无菌镊子，黑布，试管，吸管，三角涂棒

2人/组： 2只无菌平皿、2只1ml无菌吸管、2只三角玻棒、滤纸圆片5片； 1个大台面公用： 菌种：大肠杆菌菌液、枯草芽孢菌菌液； 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯琼脂斜面培养基； 器材：2.5%碘酒，5%石炭酸，75%乙醇，新洁尔灭，无菌生理盐水，镊子，黑布；

四、实验步骤 （一）化学因素 1、将已经灭菌并冷却到50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中，水平放置待凝固，做标记； 2、用无菌吸管吸取0.２ mL培养18 h的枯草芽孢杆菌菌液（1皿）或大肠杆菌菌液（1皿）加入上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀；

3、将已经涂布好的平板底皿划分为4等份，每一等份内标明一种消毒剂(2.5%碘酒，5%石炭酸，75%乙醇，新洁尔灭)的名称； 4、用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片分别浸入装有各种消毒剂中浸湿，在皿中间放入浸过无菌生理盐水的小圆滤纸片对照； 5、将上述贴好滤纸片的含菌平皿倒置放于37℃条件下培养24 h后观察并用直尺测量抑菌圈的大小。（见图1）

图1 圆滤纸片法测药物杀菌作用 1.滤纸片 2.有菌区 3.抑菌区 图1 圆滤纸片法测药物杀菌作用 1.滤纸片 2.有菌区 3.抑菌区

（二）生物因素（抗生素） 1.倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基熔化后倒平板。 2.贴滤纸条 无菌操作，用镊子取无菌滤纸条分别浸入青霉素、洁霉素或庆大霉素溶液溶液润湿，在容器内壁沥去多余溶液，再将滤纸条贴在平板上。

3、接种 无菌操作，用接种环分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，从滤纸条边缘分别垂直向外划线接种。见图2. 4、培养、观察 将上述平板倒置于37℃保温24h，观察细菌生长状况并纪录

试验菌接种区 试验菌 培养 滤纸条 图2 抗生素抗菌谱试验示意图

（三）紫外线杀菌实验 1、将已经灭菌并冷却到50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中，倒2只平皿，水平放置待凝固，做标记； （三）紫外线杀菌实验 1、将已经灭菌并冷却到50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中，倒2只平皿，水平放置待凝固，做标记； 2、用无菌吸管分别吸取0.２ ml培养大肠杆菌菌液加入上述2只平皿中，用无菌三角涂棒涂布均匀涂布大肠杆菌菌液； 3、将其中一只平皿盖子打开，至于超净工作台紫外灯下照射10 min，合上盖子，另一只平皿对照（不照射），用黑布包裹在一起，倒置37 ℃培养，24 h后观察并记录实验结果。

（四）温度实验 1、将已经灭菌并冷却到50 ℃左右的马铃薯琼脂斜面培养基倒入无菌培养皿中，倒2只平皿，水平放置待凝固，做标记； 2、用无菌吸管分别吸取0.２ mL培养酵母菌菌液加入上述2只平皿中，用无菌三角涂棒涂布均匀涂布酵母菌菌液,做标记； 3、分别放在28℃和50℃条件下倒置培养，24h后观察并记录实验结果。

五、实验任务（2人/组）： 1.化学因素实验：1只接有枯草芽孢杆菌菌液或大肠杆菌菌液平皿，每皿放入4片浸入过不同的消毒剂的滤纸圆片（放在皿的四周）和1片浸入无菌生理盐水的滤纸圆片（放在皿的中央），24h观察测量； 2.抗生素实验：1只检测青霉素、洁霉素或庆大霉素的平皿，24h观察测量 。 课后及时观察并记录实验结果，分析结果。

六、实验报告 1、结果 （1）列表比较四种化学消毒剂对两种细菌的杀（抑）菌作用。（“－”表示不生长，“＋”表示生长较差，“＋＋”生长一般，“＋＋＋”表示生长良好） （2）绘图表示并说明青霉素、洁霉素和庆大霉素对三种菌的抑菌效能，解释其原理。 2、思考题 （1）影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？抑（杀）菌圈大小是否准确地反映出化学消毒剂地抑菌作用还是杀菌作用？ （2）如果抑菌带内隔一段时间后又长出少数菌落，你如何解释这种现象。

结 束 请注意实验台面清洁！ 请值日生留下来打扫卫生！