第十一章 抗生素类药物的分析 The Analysis of Aantibiotic drugs

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第十一章 抗生素类药物的分析 The Analysis of Aantibiotic drugs

第一节 概   述 抗生素的来源: *多数抗生素生物合成(发酵) *少数化学合成或者半合成

1、抗生素类药物一般检查项目: ①鉴别试验: 用化学法、物理化学法以 及生物学法来确认是哪种抗生素 ②毒性试验: 控制药品中的毒性物质 ③无菌试验: 检查药品中有无杂菌污染 ④热源试验: 控制药品中的致热物质

⑤水分测定: 控制水分含量 ⑥溶液澄明度检查: 检查不溶性物质 ⑦ 溶液pH试验: 测定pH ⑧降压试验: 检查有降压作用的杂质 ⑨   效价测定: 有效成分测定

2、效价测定 抗生素的效价测定方法有: 生物学法 物理化学法 目前各国药典仍以生物学测定法为主。

(1)     生物学测定法 以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准 优点: ①原理恰好与临床要求一致,更能 够确定抗生素效价。 ②灵敏度高,需要样品量较小

③ 既适用较纯精制品,也适用于纯度 较差的产品 ④ 已知或新发现抗生素都能应用 ⑤ 同一类型的抗生素,不需要分离, 可一次测定它们的总效价。

缺点 ①   操作步骤多,测定时间较长 ②   误差较大

(2) 物理化学测定法 根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。 优点 ① 操作简单、省时、方法准确 (2)     物理化学测定法 根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。 优点 ①   操作简单、省时、方法准确 ②   具有较高的专属性

缺点: 对于结构相似的抗生素,测定结果往往只能代表总的含量,并不一定能代表某一抗生素的生物效价,只有当用物理化学法测定结果与用生物学法测定效价相一致时,才能用于效价测定。

3、本章内容 * -内酰胺类: 青霉素类头孢菌素类 *氨基糖苷类: 链霉素 庆大霉素 *四环素类:

第二节 -内酰胺类抗生素的分析 一、化学结构与性质 1、化学结构 ①   青霉素类结构

*青霉素类: 母核: 由-内酰胺环和氢化噻唑环 组成的双杂环。 6-APA 6-Aminopenicillanic Acid 侧链 : RCO-  

苄青霉素(青霉素G) R= 氨苄青霉素 R=

② 头孢菌素类结构 母核: -内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。 (7-ACA)7-Aminocephalospoanic Acid ②  头孢菌素类结构 母核: -内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。 (7-ACA)7-Aminocephalospoanic Acid 侧链 RCO- 

2、性质 青霉素类和头孢菌素类结构共同特点具有-内酰胺环。 ① 酸性 *有羧基,具有酸性 *pKa值在2.5~2.8之间 *与碱成盐 ①   酸性 *有羧基,具有酸性 *pKa值在2.5~2.8之间 *与碱成盐 如:青霉素G钠、青霉素G钾等

②  旋光性 有手性碳原子,具有旋光性 3个手性碳原子 2个手性碳原子

③ 紫外吸收 * 青霉素类母核没有共轭系统,没有紫外吸收 ③  紫外吸收 * 青霉素类母核没有共轭系统,没有紫外吸收 * 但青霉素类药物在弱酸性下水解,可以产生具有共轭双键的青霉烯酸,在紫外光区有吸收。 * 侧链中有苯环等取代基的药物,在紫外光区也有吸收。像苄青霉素。

头孢菌素类分子中有共轭体系 (O=C-N-C=C) 在260nm处有最大吸收。

④  -内酰胺环的不稳定性 干燥、纯净青霉素类抗生素稳定,其水溶液很不稳定. 不稳定的部分是-内酰胺环 -内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下,可使-内酰胺环开环或发生分子重排,而失去抗菌作用。

ⅰ ⅱ

ⅲ ⅳ

二、鉴别试验 1、羟肟酸铁反应

2、青霉素的各种盐的鉴别 3、硫酸及硫酸-甲醛反应 4、硫酸-变色酸反应 5、紫外分光光度法及红外分光光度法

三、含量测定 1、酸碱滴定法 ①   原理 青霉素在稀碱性条件下,水解生成青霉 噻唑酸衍生物,此步水解定量完成,可用 于含量测定。

① 方法 (ⅰ) 水解前:将样品溶液的pH调至8 (ⅱ) 水解:加入定过量的标准碱溶液, 水浴加热使水解 ①   方法 (ⅰ) 水解前:将样品溶液的pH调至8 (加0.01mol/L NaOH液至显粉红色) (ⅱ) 水解:加入定过量的标准碱溶液, 水浴加热使水解 (ⅲ) 剩余滴定:水解后,过量的碱用酸 标准液回滴定(至pH8,粉红色→无色)

以“青霉素钠”为例 ChP 90 (1)主试验 (2)空白试验: 不加样品,其余操作同上

③ 讨论 (ⅰ) 溶剂 新沸过且用0.01M NaOH液中和的水 目的:消除水中酸性物质影响(如CO2) (ⅱ) 滴定前中和 ③   讨论 (ⅰ) 溶剂 新沸过且用0.01M NaOH液中和的水 目的:消除水中酸性物质影响(如CO2) (ⅱ) 滴定前中和 消除能消耗碱的杂质影响(如一些酯 类杂质)

(ⅲ) 空白试验目的: 在加热水解过程中,有可能会吸收CO2,对测定有影响,所以要做空白试验校正。 (ⅳ) 本法供试品用量较大,多用于效价高的供试品的测定

2、碘量法 ① 原理: 青霉素或头孢菌素分子不消耗碘,其 在碱性条件下水解生成的降解产物— 青霉噻唑酸可与碘作用,根据消耗的 碘量可以计算青霉素的含量。

理论上:1mol青霉素≈8mol I原子 实际上: 1mol青霉素≈8~9mol I原子 ※温度,放置时间,pH,浓度,碘过量程度, 杂质多少等影响因素。

②方法: 以“青霉素钠”为例,ChP 二部 (1)主试验:

(2)空白试验:

③ 讨论: (1)溶液的pH值在4.5左右 (2)温度:24~26℃ (3)放置时间:15~20′

(4)空白试验:做法与一般空白不同(加样品,不加碱水解,其他操作同样品) *目的:消除样品中预先存在的降解产物(青霉噻唑酸)及其他耗碘杂质的影响 (5)灵敏度高:因为1:8,所以供试液浓度在 10~100μg/ml即可测定

3、汞量法 ① 原理: 青霉素分子不与汞盐反应,但其降 产物青霉噻唑酸及青酶胺可与汞盐反应, 根据消耗的汞盐量计算青霉素的含量。

青霉素分子中的氢化噻唑环含有一个硫原子,开环后形成巯基(—SH),可用汞量法测定

4、可见—紫外分光光度法 青霉素在弱酸性下(pH=4),不完 全水解,产生青酶烯酸,在320—360nm 处有强吸收。 ① 原理: 青霉素在弱酸性下(pH=4),不完 全水解,产生青酶烯酸,在320—360nm 处有强吸收。 青霉烯酸在酸性溶液中极不稳定,有 两种改进方法。

铜离子与青酶烯酸形成稳定的螯合物,在320nm处有最大吸收。 (1)铜盐法(JP13): 铜离子与青酶烯酸形成稳定的螯合物,在320nm处有最大吸收。 对照品法定量。 用于氨苄青霉素的含量测定。

(2)硫醇汞盐法(BP1993) (ChP95) 对照品→同样操作 用于氨苄西林钠的含量测定 青霉素在咪唑的催化下,与氯化高汞定量地反应生成青酶烯酸硫醇汞盐,在324—345nm下有最大吸收。 对照品→同样操作 用于氨苄西林钠的含量测定

作用: 咪唑:催化剂,使水解产率高,生成产物稳定 醋酐的乙腈溶液:乙酰化氨苄青霉素侧链 —NH2,使λmax=325nm 硼酸缓冲液:调pH值 HgCl2:微量Hg2+催化剂,促进反应,重现性好。

5、HPLC 以“头孢唑林钠”为例 色谱条件: 柱:ODS 流动相:磷酸二氢钾、枸橼酸溶液— 乙腈(88:12) 检测波长:254nm 流动相:磷酸二氢钾、枸橼酸溶液— 乙腈(88:12) 检测波长:254nm 内标物:乙酰苯胺

第二节 氨基糖甙类抗生素的分析 一、化学结构及性质 (一)链霉素 1、结构 链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡萄糖胺

2、性质: (1)三个碱性中心: 2个强碱性胍基(PKa=11.5) 1个甲胺基(PKa=7.7) 可与矿酸或有机酸成盐 (2)链霉素在酸性或碱性条件下可变为链霉胍和链霉双糖胺

(二)庆大霉素 1、结构 紫素胺 脱氧链霉胺 N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺 *三个类似结构的C1、C2、C1a组成的混合物 C1:R1=R2=CH3 ;C2:R1=CH3,R2=H ;C1a:R1=R2=H,R3=H

2、性质: (1)五个碱性中心——PKa~8 可与矿酸或有机酸成盐 (2)无UV吸收,(因为无共轭系统)

二、鉴别试验 (一) 共同反应 1、茚三酮反应 氨基糖苷结构,具羟基胺类和α— 氨基酸的性质,可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物。

2. N-甲基葡萄糖胺反应: 水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应

(二)链霉素的特征反应 1、麦芽酚反应: 链霉素在碱性溶液中,链酶糖经分子重排,消除N—甲基葡萄糖胺及链酶胍,生成麦牙酚,麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。

2、坂口反应: 本品水溶液,加氢氧化钠试液,水解为链酶胍,与8—羟基喹啉作用,再加次溴酸钠试液,生成橙红色化合物。

第三节 四环素类抗生素的分析 一、化学结构 四骈苯或萘骈萘的衍生物, 氢化骈四苯环

四个取代基 R R′ R″ R′″ 四环素(TC) H OH CH3 金霉素(CTC) Cl 土霉素(OTC)

四个环 A环 B环 C环 D环 二甲氨基—N(CH3)2 酚羟基 酰胺基—CONH2 酮基与烯醇共共轭 酮基与烯醇基共轭 双键系统

二、性质 1、呈两性: 弱酸性——酚羟基、烯醇型羟基 弱碱性——二甲胺基 所以遇酸或碱均可成盐

2、含结晶水 四环素:6个结晶水占19.6% 土霉素:2个结晶水占7.5% 加热时可失去结晶水,当含水量 低于19.6%的四环素和低于7.5%的土 霉素,置于空气中要吸收水分。

3. 溶解度: 游离体在水中溶解度很小,溶解度与pH有关。pH4.5~7.2难溶于水, pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.

4.对氧化剂不稳定: 对各种氧化剂都不稳定,且碱性水溶液特别易氧化,颜色很快变深形成色素,干燥品较稳定,但贮存时遇光可使颜色变深(因空气氧化)。

三.化学反应: 1. 差向异构化反应:(差向四环素) 弱酸性(pH2.0~6.0)溶液中,A环上手性C4构型的改变,发生差向异构化,形成差向四环素。 差向化速度的影响因素:pH<2或 pH>9时,差向化速度很小。高价的无机酸或有机酸根存在或阴离子浓度增加,差向化速度增大。

*四环素和金霉素很易差向异构化,形成4-差向四环素、4-差向金霉素,他们的抗菌性极弱或完全消失。 *土霉素和强力霉素由于C5上的羟基和二甲胺基形成氢键,不易发生差向异构化。

2. 酸性下降解反应:(脱水四环素类) 在酸性(pH<2)时,C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水,在C6-C5a间形成双键。经重排使C环芳构化,生成脱水四环素类 四环素、土霉素和金霉素可发生脱水;强力霉素不发生(C6无OH)。

3. 碱性下降解反应:(异四环素类) 在碱性下,C环打开,生成无活性的具有内酯结构的异四环素;若强碱性下加热,可定量地转化为异四环素,后者具有强烈荧光,可荧光法测定。 强力霉素不发生反应,因C6无OH。

4. 与金属离子络合: 能与许多金属离子(锆Zr4+,铀U6+,锌Zn2+,铜Cu2+,铝Al3+,镁Mg2+,铈Ce4+,钴Co2+)形成有色络合物。

四.鉴别 1.  与浓硫酸反应: 四环素类 + 浓H2SO4 → 深紫色(四环素) 蓝色,迅速转变为绿(金霉素) 朱红色(土霉素)

2. FeCl3反应:   四环素类酚羟基 + FeCl3 → 红棕色(四环素) 深褐色(金霉素) 橙褐色(土霉素)

3.  荧光反应: 四环素类在紫外灯下产生荧光,其降解产物也具有荧光,可供鉴别。

五.杂质检查: 降解产物及异构杂质,会造成药品质量 下降。可引起恶心、呕吐、糖尿、蛋白尿 及酸中毒,称为Fanconi症侯群。

引起毒性反应的主要物质为差向 异构体、脱水物、差向脱水物质,统 称为有关物质。 ChP2005采用HPLC法检查。 脱水物和差向脱水物含量越高, 其吸收度越大,因此,ChP还规定杂 质的吸收度的限量。