微生物与发酵工艺 知识点3.1

知识点3.1 第一节 工业生产常用的微生物及要求 第二节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏 知识点3.1 第一节 工业生产常用的微生物及要求 第二节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏

知识点3.1 第三节 工业微生物菌种的选育 第四节 生产菌种的改良 第五节 种子的扩大培养 知识点3.1 第三节 工业微生物菌种的选育 第四节 生产菌种的改良 第五节 种子的扩大培养

第一节 工业生产常用的微生物及要求 一、工业生产常用的微生物 ⒈ 细菌 工业生产常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 第一节 工业生产常用的微生物及要求 一、工业生产常用的微生物 ⒈ 细菌 工业生产常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等等。

⒉ 酵母菌 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。 分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶(lipase)以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。

酿酒酵母的菌落 大肠杆菌的菌落

⒊ 霉菌 工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等。它们可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素(steroid hormone)等。

⒋ 放线菌 在液体浸没培养中由于搅拌器的剪切应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。

放线菌的最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotic)。 从微生物中发现的抗生素，有60％以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。 常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。

⒌ 担子菌 ⒍ 藻类 灵 芝 螺旋藻

二、微生物工业对菌种的要求 ⑴ 原料廉价、生长迅速、目的产物产量高； ⑵ 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； ⑶ 抗杂菌和噬菌体的能力强； ⑷ 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。

第二节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏 一、微生物菌种的衰退 ⒈ 菌种衰退的原因 菌种衰退的原因有两个方面： 一是菌种保藏不妥； 第二节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏 一、微生物菌种的衰退 ⒈ 菌种衰退的原因 菌种衰退的原因有两个方面： 一是菌种保藏不妥； 二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。

此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。 菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身衰退的主要原因。 微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为10-8～10-9，保藏在0～4 ℃时这一突变概率更小，但仍然不能排除菌种衰退的可能。

菌种的回复突变是指突变菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。

突变不完全造成菌体遗传组成的差异。

⒉ 菌种性能的改变 ⑴ 菌种遗传特性的改变 ① 异核现象导致微生物群体发生变异。 ② 自发突变导致菌种遗传特性改变。 ③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。 比较：基因型和表 型

① 一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。 ⑵ 菌种生理状况的改变 ① 一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。 如灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 链霉菌属孢子丝的主要类型 链霉素分子式

② 菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。 ③ 在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。 ⒊ 防止菌种衰退的措施 ⑴ 菌种的分离 如芽孢杆菌 如AT3.942栖土曲霉 黑曲霉

⑵ 菌种的复壮 狭义的复壮与广义的复壮 比较：正突变和负突变 ⑶ 提供良好的环境条件 发酵生产上一般只用三代内的菌种 ⑷ 用优良的保藏方法 ⑸ 定期纯化菌种

二、菌种的复壮 ⑴ 纯种分离 菌落纯 细胞纯 ⑵ 通过寄主体进行复壮 如杀螟杆菌 ⑶ 淘汰已衰退的个体 如“5406”菌种 单核细胞 枯草芽孢杆菌菌落 单核细胞 米曲霉菌落

三、菌种的保藏 ⒈ 菌种保藏的原理 ⒉ 菌种保藏方法 ⑴ 斜面低温保藏法 ⑵ 液体石蜡封存保藏法 ⑶ 固体曲保藏法 ⑷ 砂土管保藏法 液氮保藏菌种 三、菌种的保藏 ⒈ 菌种保藏的原理 ⒉ 菌种保藏方法 ⑴ 斜面低温保藏法 ⑵ 液体石蜡封存保藏法 ⑶ 固体曲保藏法 ⑷ 砂土管保藏法 ⑸ 冷冻干燥法 ⑹ 液氮超低温保藏法 中温大曲

简易冷冻干燥法

液氮罐 低温冰箱

⒊ 菌种保藏的注意事项 ⑴ 菌种在保藏前所处的状态 ⑵ 菌种保藏所用的基质 低温保藏斜面培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。 ⑶ 操作过程对细胞结构的损害 冻结速度 真空干燥程度

第三节 工业微生物菌种的选育 自然选育 主要通过突变和筛选来育种 经验育种 诱变育种 常规的杂交育种 菌种选育 杂交育种 原生质体融合 第三节 工业微生物菌种的选育 菌种选育 经验育种 定向育种 自然选育 诱变育种 杂交育种 分子育种 主要通过突变和筛选来育种 常规的杂交育种 原生质体融合 通过DNA重组技术来育种

一、自然选育 ⒈ 从自然界分离获得菌株 ⑴ 采样 ⑵ 增殖培养 ⑶ 纯种分离 ⑷ 生产性能的测定 稀释法 划线法

⒉ 从自发突变体中获得菌株 自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。 微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌种（突变株）常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，因此常常表现出生活力比野生菌株弱、遗传特性不够稳定的特点。

二、诱变育种的程序 比较：野生菌株与突变菌株 比较：负变异株与正变异株 ⒈ 出发菌株的选择 ⒉ 菌悬液的制备 ⒊ 前培养 ⒋ 诱变 ⒌ 变异菌株的分离和筛选 青霉

↓ UV与光复活交替处理 +LiCl复合诱变 目的突变菌株TK0303的诱变图谱 诱变过程 L-亮氨酸产量/g•L-1 发酵方式 黄色短杆菌 分批发酵 （恒温28℃） 补料分批发酵 （变温控制） TQ9806(Rifr300μg/mL) 18.5 21.3 22.7 ↓自发突变 TK0301(Rifr400μg/mL) 21.8 23.1 24.3 ↓DES+LiCl复合诱变 TK0302(Rifr600μg/mL) 23.5 25.9 26.6 ↓UV+LiCl复合诱变 TK0303(Rifr800μg/mL) 25.2 27.7 28.3 ↓ UV与光复活交替处理 +LiCl复合诱变 TK0304(Rifr1000μg/mL) 26.4 28.0 26.9

导致微生物同步生长的选择法

三、诱变育种方案设计 ㈠ 突变的诱发 诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。 ⒈ 诱变剂接触DNA分子 ⒉ DNA损伤的修复 光复活作用 切补修复 重组修复 SOS修复系统 DNA多聚酶的校正作用

⒊ 从前突变到突变 光复活作用 校正差错 不利于突变 切补修复 修复系统 DNA多聚酶校正作用 重组修复 有利于突变 引起差错 SOS修复系统 不利于突变 有利于突变

⒋ 从突变到突变表型 突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。 表型迟延有两种原因： 分离性迟延 生理性迟延 前突变 突变 突变表型 比较：基因型与表型

㈡ 诱变剂的种类及选择 ⒈ 诱变剂 物理诱变剂和化学诱变剂 ⒉ 影响诱变效果的因素 ㈢ 出发菌株的选择 ① 选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。 ② 选择出发菌株，不仅是选产量高的，还应该考虑其他因素。 ③ 选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。

㈣ 筛选的方法 ⒈ 制定筛选方案 整个流程可分为诱变和筛选两部分。 筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。 ⒉ 营养缺陷型的筛选方法 比较：营养缺陷型（auxotroph）、原养型（prototroph）、野生型（wild type） 比较：基本培养基（MM）、完全培养基（CM）、补充培养基（SM）

二次诱变 突变菌株 负（正）变株、营养缺陷型等 回复突变株

黄色短杆菌的代谢过程 天冬氨酸 抑制 中间产物Ⅰ 天冬氨酸激酶 高丝氨酸 脱氢酶 中间产物Ⅱ 甲硫氨酸 苏氨酸 赖氨酸

不能合成 人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸 可以大量积累 天冬氨酸 中间产物Ⅰ 中间产物Ⅱ 甲硫氨酸 苏氨酸 高丝氨酸 天冬氨酸激酶 人工诱变的 菌种不能产生 高丝氨酸 脱氢酶 中间产物Ⅱ 不能合成 甲硫氨酸 苏氨酸 高丝氨酸 赖 氨 酸 可以大量积累

营养缺陷型的筛选，一般是经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等步骤。 甲硫氨酸缺陷型菌株

夹层平板法

⒊ 突变株的筛选 透明圈

育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。 ⑴ 随机筛选 ① 摇瓶筛选法

② 琼脂块筛选法 ③ 筛选自动化和筛选工具微型化

⑵ 理性化筛选 初级代谢产物高产菌株的筛选 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选 ① 初级代谢产物高产菌株的筛选 Ⅰ 降低终产物浓度 (a) 筛选终产物营养缺陷型

反馈抑制模式图

反馈阻遏 a b c d A B C D E 发酵产物 限量供给 反馈抑制

赖氨酸高产菌株的代谢调控机制

(b) 筛选细胞膜透性改变的突变株 如用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型(biotin deficiency)进行谷氨酸发酵 Ⅱ 筛选抗反馈突变菌株 (a) 筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株 如选育L-精氨酸（L-Arg）高产菌株，可采用筛选结构类似物D-Argr菌株的方法 一般文献中采用上标“r”表示抗性，“s”表示敏感型

(b) 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

能够生长的培养基 菌株 野生型菌株 营养缺陷型菌株 原养型菌株 突变 回复突变 或基因重组 MM或CM SM或CM

② 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选。 质粒产物 分叉中间体 (a) 利用营养缺陷型筛选 渗漏缺陷型(leaky mutant)是遗传性障碍不完全的营养缺陷型 一般文献中采用上标“-”表示营养缺陷型，上标“L”表示渗漏缺陷型 例如：Met-+ ThrL表示甲硫氨酸缺陷和苏氨酸渗漏

反馈调节 芳香族氨基酸 莽草酸 分叉中间体 氯霉素 芳香族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素

(b) 筛选负变株的回复突变株 (c) 筛选去磷酸盐调节突变株 抑菌圈

(d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株。 “葡萄糖效应” 葡萄糖的（毒性）结构类似物也可用于筛选去碳源分解代谢调节突变株

(e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。 赖氨酸 α-氨基己二酸 青霉素 反馈调节 筛选赖氨酸结构类似物抗性突变株，可以促进青霉素合成 分叉中间体 青霉素

(f) 筛选二价金属离子抗性突变株 (g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 (h) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株 ㈤ 突变基因的表现 菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件 例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变株

第四节 生产菌种的改良 一、常规的杂交育种 青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生殖的过程

重组型分离子 染色体交换 杂合二倍体 菌丝联结 质配 核配 异核体 单倍化 亲本型分离子

二、原生质体融合 原生质体融合一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌株的筛选等。

主要试剂：脱壁酶、聚乙二醇(PEG)和Ca2+

原生质体融合过程简介如下 ： ⒈ 标记菌株的筛选 ⒉ 原生质体的制备 ⑴ 菌体的预处理 ⑵ 菌体的培养时间 ⑶ 酶浓度 ⑷ 酶解温度 ⑸ 酶解时间 ⑹ 渗透压稳定剂

⒊ 原生质体的融合与再生 ⒋ 融合子的选择 ⒌ 灭活原生质体融合技术在育种中的应用 ⑴ 单一亲株灭活 ⑵ 双亲株或多亲株灭活

三、DNA重组技术 ㈠ DNA重组过程 重组DNA技术一般包括四步，即目标DNA片段的获得、与载体DNA分子的连接、重组DNA分子引入宿主细胞及从中选出含有所需重组DNA分子的宿主细胞。 作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。 ㈡ 分子育种技术 通过基因工程改造后的菌株称为工程菌

利用基因工程技术生产氨基酸

第五节 种子的扩大培养 一、种子扩大培养的任务 二、种子制备的过程 ⒈ 孢子制备 ⑴ 放线菌孢子的制备 菌种进入种子罐有两种方法： 第五节 种子的扩大培养 一、种子扩大培养的任务 二、种子制备的过程 ⒈ 孢子制备 ⑴ 放线菌孢子的制备 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法 摇瓶菌丝进罐法 搅拌种子罐

⑵ 霉菌孢子的制备 ⒉ 种子制备 ⑴ 摇瓶种子制备 ⑵ 种子罐种子制备 比较：种子制备的目的和发酵的目的

种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。 种子罐级数减少，有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。

酵母菌的三级培养过程

三、种子培养 ⒈ 表面培养法 ⒉ 固体培养法 ⒊ 液体深层培养

四、种子质量的控制 ㈠ 影响孢子质量的因素及其控制 ⒈ 培养基 ⒉ 培养温度和湿度 例如：龟裂链霉菌斜面 ⒊ 培养时间和冷藏时间 ⑴ 孢子的培养时间 ⑵ 孢子的冷藏时间 ⒋ 接种量

㈡ 影响种子质量的因素及其控制 ⒈ 培养基 ⒉ 培养条件 ⒊ 种龄 在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。 ⒋ 接种量 双种法；倒种法；混种法

分批发酵条件下，黄色短杆菌TK0303的菌体形态变化 5L罐延迟期（4h） 5L罐对数期（32h） 5L罐稳定期（48h） 5L罐衰亡期（68h） 摇瓶衰亡期（72h）

⒌ 种子质量标准 ⑴ 细胞或菌体 ⑵ 生化指标 ⑶ 产物生成量 ⑷ 酶活力 ⒍ 种子异常的分析 ⑴ 菌种生长发育缓慢或过快 ⑵ 菌丝结团 放线菌 ⒌ 种子质量标准 ⑴ 细胞或菌体 ⑵ 生化指标 ⑶ 产物生成量 ⑷ 酶活力 ⒍ 种子异常的分析 ⑴ 菌种生长发育缓慢或过快 ⑵ 菌丝结团 ⑶ 菌丝粘壁

霉菌菌丝 菌丝团

思 考 题 ⒈ 微生物有哪些特点?试举例说明微生物的工业应用。 ⒉ 工业生产中使用的微生物菌种为什么会发生衰退？菌种衰退表现在哪些方面？防止菌种衰退的措施有哪些？

思 考 题 ⒊ 简要说明诱变育种的步骤。诱变育种应注意哪些问题？ ⒋ 试比较诱变育种技术、原生质体融合技术、DNA重组技术三种育种方法的优缺点。 ⒌ 影响种子质量的因素有哪些?如何控制种子质量？