第九章 生物物质分离与纯化 王雪青

9.1概述 生物物质分离（Bioseparation)是生物化工的一个重要的组成部分，常称之为下游过程（Downstream processing）。其与上中游同样重要，在某种程度上，甚至大于它们。前者解决丰产问题，而下游分离过程解决丰收问题。 生物物质的分离区别于其它物质的分离在于 A: 目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也相应的增加。 B: 生物物质易受环境因素如温度、pH、金属离子和微生物等的影响，增加了分离的难度。 C: 对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制剂的产品。 因此它是一项十分艰巨和耗资巨大的工作。对于传统发酵工业

Separation Processes:

产品 典型浓度（g/L) 抗生素 氨基酸 酒精 25 100 有机酸 酶 R-DNA蛋白质 20 10 来说，（如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产), 分离和提纯部分费用占总投资的60%，而对基因工程菌的发酵占到90%，对其下功夫研究和设计是一项十分重要和有意义的工作。 表 9-1 几种典型产品发酵液的浓度 产品 典型浓度（g/L) 抗生素 氨基酸 酒精 25 100 有机酸 酶 R-DNA蛋白质 20 10

下游加工过程应遵循的原则 时间短； 温度低 pH适中 严格的清洗和消毒

下游加工一般工艺流程 发酵液 胞外产物 细胞分离 胞内产物 离心或过滤 离心或过滤 离心或过滤 细胞破碎 整体细胞萃取 干燥 含产物的清液 提取、分离 废物 纯化、精制 干燥 产物

一、发酵液的预处理 改变发酵液的性质，以利于固液分离。通过酸化、加热、以降低发酵液的黏度。 通过加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚乙烯亚胺衍生物，天然的有机高分子物质，如壳聚糖和葡聚糖的聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮凝法常可得到粗大的絮团。 通过加入一些中性盐，导致胶体出现凝聚的不稳定的现象。表征电解质凝聚能力的大小用凝聚价，即使胶粒 发生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高该值就越小，凝聚能力就越强。常用的凝聚剂为明矾，AlCl3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3。采用凝聚的方法得到的凝聚体颗粒比较小。

二、发酵液的固液分离 通过固液分离，去除了发酵液中的固相物质，为后续过程提供澄清或洁净的原料液体。通常采用的单元操作为过滤和离心。

分离速度低，分离效果受物料性质变化影响，劳动强度大 过滤设备的种类和特点 设备 特点 缺点 板框过滤机 平板过滤机 真空旋转过滤机 管式过滤机 蜂窝式过滤机 深层过滤机 设备简单，操作容易，适合大规模工业生产 分离速度低，分离效果受物料性质变化影响，劳动强度大

设备 特点 缺点 高速冷冻离心机 碟片式离心机 管式离心机 倾析式离心机 框式离心机 主要离心设备 适用于粒径小，热稳定性差物质的回收，常试验实用 适用于大规模生产，可连续或间歇操作，稳定性好，以放大和推广。 批式操作、转速高、分离效果好，含水率低，易放大。 连续操作，易放大和工业应用，操作稳定。 适用于大颗粒物质回收，放大易，适于工业应用。 容量小，连续操作和规模化生产困难， 半连续或间歇操作出渣及清洗繁杂，连续操作出渣的固形物含水率大。 容量有限，噪声大。 设备投资高，小颗粒物质回收困难。 分离效果差，设备投资高，操作成本高。

Disc-Centrifuges Solids-retaining Nozzle with pressurized discharge of concentrate Nozzle with peripheral nozzles Periodically solids-ejecting centrifuge with axial channels Periodically solids-ejecting centrifuge

Centrifuges

三、细胞破碎 破碎方法 机械方法 非机械方法 流体剪切力 固体剪切力 干燥处理 溶胞处理 高压匀浆 酶溶法 化学法 物理法 超声法 球磨法 压榨法

压力破碎法：利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。 珠磨破碎法：利用固体的剪切进行破碎。操作简单，可连续/批式操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不同细胞的破碎条件差异大。 超声破碎法：利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单，可连续/批式操作，但操作会产生热，需有冷却系统，破碎率低，适应性差。 渗透压法：利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎。破碎率低，产物释放较好，操作复杂，条件要求苛刻，适用于少量样品的处理，费用高。 有机溶剂法：利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁/膜的通透性，使包内产物释放的方法。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但适用面窄。

大规模，则一般采用机械法，而实验室规模的，则选择非机械法。 细胞壁的强度和结构： 碱或酶处理法：利用碱或酶的处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法简单，可规模化生产，但适用面窄。 选择破碎法的依据： 细胞的处理量： 大规模，则一般采用机械法，而实验室规模的，则选择非机械法。 细胞壁的强度和结构： 酵母和真菌，含有纤维素和几丁质，比细菌的胞壁强度大，应选择高压匀浆法。而对于有高度分之的微生物，会阻塞匀浆气阀而不能应用。 目的产物对破碎条件的敏感性： 破碎程度：由于破碎会使细胞碎片细小，使固液分离困难， 所以，适宜的操作条件是高的产物释放率，低能耗和便于后续提取三个方面权衡。

Cell disruption equipment

四、分离和纯化 主要任务是提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质。传统的方法包括沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法，另外，含有超滤、反渗透，电渗析、凝胶电泳等，常用的为蒸发、萃取和吸附。 1. 液体蒸发：又称浓缩，通过加热是溶液中的部分水汽化并出去，以提高溶液的浓度。蒸发的持续进行必须满足而个条件：其一，保证连续的提供不断汽化所需的热量，同时不断的移去二次蒸汽。 2. 液-液萃取：是一种常用的方法。应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的分离和提取。特别是近20年，与其它的技术性结合产生了新的分离技术，用于提取酶、蛋白质、核酸、多肽和氨基酸。 如：反胶囊萃取（reversed micelle extraction), 超临界萃取（supercritical fluid extraction )和液膜萃取（liquid membrane extraction)等适合DNA重组技术和遗传工程的发展

Extractors 溶质在二个互不相容的溶剂的分配系数不同，所造成的溶质的转移。 混合器和澄清器

3. 双水相萃取； 二种互不溶的聚合物，这两种的聚合物中的含水率很高，一般在70-90%，这样就可以防止在有机相中的变性，同时这些高聚物含有保护和稳定蛋白质等生物活性物质的作用。

4. 反胶团萃取； 在有机相中加入一定量的表面活性剂，形成大小为毫微米级的微胶团。当此有机相与含有目的产物的水相形成液-液萃取时，由于微胶团中的表面活性剂带有与水相中的蛋白质相反的电荷，而将水相中的蛋白质迁移入微团内水池中，实现物质的提取。 5. 超临界萃取； 同样为溶剂萃取。而此方法使用的溶剂是在超临界状态下的液态气体，常用的为CO2, 它具有液体的密度和气体的高扩散性，产品分离容易等特点。受到广泛的关注。 For pure CO2, the critical conditions ; Pressure(73atm), temperature(31.1°C)

Supercritical Fluid Extraction

6; 固体吸附： 是物质从液相（发酵液）到固相（吸附剂）发生物质的转移。此法用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分离和提取。 按照吸附剂的作用原理：分为三大类。 A物理吸附： 依靠范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛和氧化铝等。 B静电吸附： 借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。 C: 亲和吸附： 在树脂上嫁接一个能与要分离的物质发生特异性反应的配基。

五、提纯 1，层析法（Elution Chromatography) 又称洗脱法/色谱法。他们与吸附法本质上是相同的。但在操作过程不同。造成了结果不同。 吸附法吸附和洗脱间断进行，收集洗脱液也为一次性、不分段。因此，只有浓缩而无分离。 层析法则是吸附和洗脱同时进行，分段收集洗脱液，因此分离和浓缩同时完成。 层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析

Column Chromatography

Ion Exchange

Gel Filtration

Affinity Chromatography

2：沉淀法 适合大规模生产，通过采取不同的手段使发酵液中目的物质溶解度降低，使之发生沉淀，达到分离提纯的目的。 常用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉淀法等 3. 超滤法 是一种半透膜，使溶液中的溶剂和小分子物质通过，而阻止截流大分子物质的方法。 超滤区别于常规过滤主要采用了错流手段消除浓差极化

4：电泳法 在电场的作用下发生的带电粒子定向运动，其移动的速度受到物质所带电荷多少而不同，依据此而进行分离纯化的方法。 该法无法实现规模化生产，价格贵。量少。

SDS PAGE of Purification 10 micrograms loaded in each lane

六、最后加工 包括结晶和干燥

Industrial Scale up To transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting. Fermentor sizes range from 100 L to 500,000 L, depending on products.