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基因在大肠杆菌中的表达

基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。

最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。

据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。

一 真核基因在原核细胞中表达的特点

大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。 ④易培养，成本低。 基因表达的调控机理

原核体系中表达真核基因的困难 细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子； 真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上； 真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白； 表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。 5. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；

构建表达载体的策略 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。 ⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。 ⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。

二 克隆基因在大肠杆菌中的表达 有效转录的基本条件 启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。 终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。

正确翻译的基本条件 1、具备起始密码子 2、具备终止密码子 3、具有正确的阅读框 4 具有核糖体结合位点

大肠杆菌表达载体的成份 SD TT Tcr Ori R 启动子 起始密码子 终止密码子 编码序列 TT Tcr Ori R －35 －10 启动子 起始密码子 AUG、GUG、UUG 终止密码子 UAAU、UGA、UAG 大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。

大肠杆菌表达载体的成份 ⑴启动子 要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。 启动子的结构对表达效率的影响 大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成， 5’-- TTGACA故称为-35区，)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。 ⑵转录终止子: 使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。 尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。

⑶核糖体结合位点:在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD） mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。 Promoter SD AUG Gene Terminator UAA mRNA ５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG-----　16S rRNA3’ 末端

显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 (5)筛选标记 (4)增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 (5)筛选标记

常见的大肠杆菌表达系统 ①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。 ②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。 ③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。 ④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。

真核基因在大肠杆菌中的表达 融合蛋白的表达 非融合蛋白的表达 蛋白分泌型表达

蛋白质的融合表达 融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）序列的3’末端。表达出来的融合蛋白的N末端含有由担体序列编码的片段。 融合蛋白:由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。N端具有原核生物肽段或其他DNA编码的肽段，C端具有真核生物基因完整编码的蛋白质

融合蛋白配偶体：融合蛋白中与目标蛋白相连的其他蛋白组分 葡萄球菌蛋白A（SPA），硫氧还蛋白（TRX），谷胱甘肽-S-转移酶（GST） HIS标签 作用：阻止包涵体的形成，改善蛋白质的折叠功能，限制蛋白质的酶解活性，易于分离纯化

融合蛋白质的纯化 基本原理： 利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出驻外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。

融合蛋白质的切割 将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。 1.溴化氰切割法： 能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。 2. 胰蛋白酶切割法： 能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异性的切割。 3. Xa切割法： 能唯一地从特异识别序列C－末端切割多肽

非融合蛋白的表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。 包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。

蛋白质的分泌型表达 将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。 实现蛋白质分泌表达有许多有利之处： 1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。 2. 分泌的蛋白稳定。 3. 使得重组蛋白易纯化。 4. 有利于二硫键的正确形成。

表达产物的鉴定 SDS凝胶电泳 WESTERN BLOT 生物活性检测

第九节基因在酵母中的高效表达 大肠杆菌表达系统的缺陷： 1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。 2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。 因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。如酿酒酵母、甲醇酵母等。

酵母表达系统的优点 作为一种单细胞生物在操作和生产上方便 具有翻译后加工系统 形成二硫键 糖基化 去除起始甲硫氨酸

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