动物性食品微生物检验 空肠弯曲菌检验 主讲人：王福红

知识目标： 能力目标： 理解空肠弯曲菌的生物学特性。 了解空肠弯曲菌的致病性。 掌握空肠弯曲菌标准检验方法。 会制备空肠弯曲菌检验用培养基。 会对空肠弯曲菌进行检验。

空肠弯曲菌 空肠弯曲菌是胎儿弯曲杆菌的一个亚种，它除了引起动物的腹泻外，还可致牛、羊、狗的流产、不育、乳房炎以及禽类的传染性肝炎等，近十几年来，发现其引起人的腹泻和食物中毒的病例也逐年增多，许多国家报道了本病的存在，从腹泻患者粪便中分离本菌的阳性率仅次于沙门氏菌和痢疾杆菌，是一种重要的人兽共患病的病原菌。

本菌对干燥、日光和一般的消毒剂敏感，对热敏感，58℃5分钟可将其杀死，弯曲杆菌在干草、厩肥和土壤中，20℃可存活10天，6℃可存活20天。4℃牛奶中存活160天，室温内2个月以上，冷冻干燥后的菌能存活13~16个月，冻结保存3个月的新鲜鸡肉，生猪肉和牛肉中仍全部存活。即使在-79℃的冷冻精液中也仍存活。

一、生物学特性 形态及染色特性：空肠弯曲菌为革兰氏阴性，本菌在感染组织中呈弧形、逗点状、短杆状或S形，长1.5～3.5um，宽0.2～0.5um，在老龄培养物中呈螺旋形长丝或圆球形，具有一端或两端鞭毛，呈螺旋运动，运动活泼，不形成芽胞和荚膜。

培养特性：本菌为微需氧菌，在大气中和厌氧环境中均不能生长，以5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气的环境中生长最为适宜，最适温度为42℃～43℃，37℃也可生长，最适pH值7.0～7.2，对营养的要求较高，在含有裂解血或血清的培养基中生长良好。

固体培养基：菌落有两种类型 一种为不溶血、淡灰色、半透明、扁平、光滑、湿润、有光泽、边缘不规则，常沿划线蔓延生长。 另一种为不溶血、圆形、突起、光滑、边缘整齐、半透明、有光泽、呈单个菌落生长、菌落直径1～2mm。

抗原特性 本菌的抗原结构较复杂，已知的有O、H和K抗原。根据血清学分型，O抗原已有60个型，该分型方法是将菌悬液经100℃加热处理1小时，经提取可溶性的O抗原，然后致敏绵羊红细胞，进行被动血凝试验所得。K、H抗原56个血清型，该分型方法是用福尔马林化菌悬液或活菌液制备抗血清最后进行凝集反应获得的。

二、致病性 空肠弯曲菌引起人类肠炎的机理尚未完全清楚，可能与其侵袭力、内毒素及外毒素有关。 空肠弯曲菌从口进入消化道，空腹时胃酸对其有一定杀灭作用，已证明pH≤3.6的溶液对该菌有杀灭作用。所以饱餐或硷性食物利于细菌突破胃屏障。进入肠腔的细菌在上部小肠腔内繁殖，并借其侵袭力侵入粘膜上皮细胞。细菌生长繁殖释放外毒素、细菌裂解出内毒素。外毒素类似霍乱肠毒素。外毒素激活上皮细胞内腺苷酸环化酶，进而cAMP增加，能量增加，促使粘膜细胞分泌旺盛，导致腹泻。这一作用可被霍乱抗毒素所阻断。

病菌的生长繁殖及毒素还造成局部粘膜充血、渗出水肿、溃疡、出血。如果免疫力低下则细菌可随血流扩散，造成菌血症，甚至败血症，进而引起脑、心、肺、肝、尿路、关节等的损害。 本病传染源主要是家畜家禽粪便排泄物带菌污染食物、水源、玩具、用品，病人及食品加工人员的健康带菌者亦可传染，同时本病可通过接触及苍蝇等传

三、检验 食品中空肠弯曲菌的检验应按《食品安全国家标准 食品微生物学检验》中空肠弯曲菌检验方法 GB4789.9-2008 进行 。

检验程序 样品处理 预增菌与增菌 分离培养 鉴定 结果报告

1.样品处理 一般样品：取25g（或25mL）样品（水果、蔬菜、水产品为50g）加人盛有100mL Bolton肉汤的有滤网的均质袋中（无滤网的均质袋可使用无菌纱布过滤），用拍击式均质器均质1min～2min；或加人盛100mL Bolton肉汤的均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，经滤网或无菌纱布过滤。将滤液进行培养。 鲜乳、冰淇淋、奶酪等：取50g样品加人盛有50mL0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中，用拍击式均质器均质15s～30s，保留滤过液。必要时调整pH值至7.2士0.2，将液体乳制品或滤过液以20000g离心30min后弃去上清，用10mLBolton肉汤悬浮沉淀（尽量避免带人油层），再转移至90mL不含抗生素的Bolton肉汤进行培养。

贝类：取至少12个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质1min～2min，取25g样品于225mLBolton肉汤中（l：10稀释），充分振荡后再转移25mL到225mLBolton肉汤中(1：100稀释），将1：10和1：100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。 蛋黄液或蛋浆：取25g（或25mL）样品于125mLBolton肉汤中并搅匀（1：6稀释），再转移25mL到100mLBolton肉汤中并搅匀（l:30稀释），同时将l：6和1：30稀释的Bolton肉汤进行培养。 

整禽等样品：用200mL0.1％的蛋白陈水充分冲洗样品的内外部，并振荡2min～3min，经无菌纱布过滤至250mL离心管中，16000g离心15min后弃去上清，用10mL0.1％蛋白陈水悬浮沉淀，吸取3mL于100mLBolton肉汤中进行培养。 需表面涂拭检测的样品：无菌棉签擦拭样品表面，将棉签头剪落到100mLBolton肉汤中进行培养。 水样：将4L的水（对于氯处理的水，在过滤前每升水中加人5mL1mol/L硫代硫酸钠溶液）经0.45um滤膜过滤，将滤膜浸没在100mLBolton肉汤中进行培养。

Bolton肉汤 用 途：用于空肠弯曲菌的增菌。 用 途：用于空肠弯曲菌的增菌。 原 理：酵母粉提供氮源，维生素，生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；偏亚硫酸钠，丙酮酸钠提供必须的离子。 用法：称取本品27.6g,加热溶解于1000mL蒸馏水中,分装,每瓶100ml,121℃高压灭菌15分钟,冷至45～50℃时,每瓶培养基中加入5ml无菌裂解脱纤维羊或马血和1支Bolton肉汤添加剂,混匀,备用。   

⒉预增菌与增菌 预增菌：在微需氧条件下，以100r/min的振荡速度，36℃士1℃培养4h。 增菌：必要时测定增菌液的pH值并调整至7.4士0.2，42℃士1℃继续培养24h～48h。

3.分离培养 试验方法：将24h增菌液、48h增菌液以及相应的1：50稀释液分别划线接种于 Skirrow琼脂平板上 mCCD琼脂平板上 CFA显色平板上 培养：微需氧条件下42℃士1℃，24h—48h。 观察结果：观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。

空肠弯曲菌在mCCD菌落特征 可疑菌落：可疑菌落通常有光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向，直径约为1mm～2mm。

空肠弯曲菌在skirrow菌落特征 可疑菌落：灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；有些可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，直径约为1mm～2mm，边缘整齐、发亮。

空肠弯曲菌在CFA菌落特征 可疑菌落：红色、突起、湿润，菌落直径约为2mm～3mm，边缘有一圈红色的透明环，中间有一个圆形的、不透明、颜色较深的红色小点的菌落。 

4.鉴定 鉴定 弯曲菌属的鉴定 空肠弯曲菌的鉴定

（1）弯曲菌属的鉴定 挑取5个或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下42℃士1℃培养24h—48h。

取哥伦比亚琼脂平板上培养物，做下列试验： 形态观察：挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。 动力观察：挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。

氧化酶试验： 试验原理：氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。肠杆菌科阴性，弧菌科，非发酵菌阳性（个别除外）。 试验方法：用接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿滤纸上，如果在10S内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性；不变色为阴性。 阴性 阳性

微需氧条件下25℃士1℃生长试验：挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下25℃士1℃培养44h士4h，观察细菌生长情况。

（2）空肠弯曲菌的鉴定 过氧化氢酶试验 马尿酸钠水解试验 吲哚乙酸酯水解试验 药物敏感性试验（可选择） 对于确定为弯曲菌属的菌落，可使用APICampy生化鉴定试剂盒或VITEK2NH生化鉴定卡来替代过氧化氢酶、马尿酸钠水解、吲哚乙酸酯水解和药物敏感性试验的鉴定，具体操作按照产品说明书进行。

①过氧化氢酶试验 试验原理：某些细菌能产生触酶，触酶能使过氧化氢快速分解成水和氧气。 试验方法： 挑取纯培养物于一无菌管中，加2mL新配制的3%过氧化氢溶液，立刻观察。 观察结果。

过氧化氢酶试验结果:空肠弯曲杆菌产生过氧化氢酶，阳性。 液面出现气泡者为阳性反应。 无气泡者为阴性。

②马尿酸钠水解试验 试验原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，甘氨酸与茚三酮试剂作用，生成深紫色的化合物。 试验方法： 挑取菌落，加到盛有0.4mL1％马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36℃士1℃水浴放置2h或36℃士1℃培养箱中放置4h。沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，不要振荡，在36℃士l℃的水浴或培养箱中放置10min。 观察结果。

马尿酸钠试验结果:空肠弯曲杆菌产生马尿酸钠酶，阳性。 出现深紫色则为阳性 若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。

③吲哚乙酸酯水解试验 试验原理：某些细菌可产生吲哚乙酸酯水解酶，可使吲哚乙酸水解。 试验方法： 挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上，再滴加一滴灭菌水。 观察结果。

吲哚乙酸酯水解试验结果:空肠弯曲杆菌产生吲哚乙酸酯酶，阳性。 5min～10min内出现深蓝色，阳性。 若无颜色变化则没有发生水解，阴性。

④药物敏感性试验 试验方法：挑取菌落，在布氏肉汤中制备成浓度为0.5McFarland的菌悬液，再用布氏肉汤制备1：10的稀释液，在5%Mueller Hinton琼脂平板上进行涂布，静置5min后去除多余液体，将平板在36℃士1℃培养箱中放置10min进行干燥。将头孢霉素（30ug）和萘啶酮酸（30ug)药敏纸片放在琼脂表面。 培养：微需氧条件下36℃士1℃，22h士2h。 结果观察：如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性；如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感。 空肠弯曲杆菌头孢霉素抗性；萘啶酮酸敏感。

5.结果报告 综合以上试验结果，报告检样单位中检出或未检出空肠弯曲菌。

Thank You!