许冰莹, Tel:0871-65922837；13769175605 Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院

DNA多态性 DNA长度多态性 DNA序列多态性 差异表现在DNA片断长度上 差异表现在DNA碱基序列上

1983年（琳达），1986年（多恩）被强奸杀害案 1985年安德鲁移民案

Examples of DNA in the News 2004 Indian Ocean Tsunami 2001 “911”, New York 2008 Wenchuan Earthquake

第四章 DNA长度多态性 （DNA length polymorphism) 第一节 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymporphism, RFLP） ＊第二节聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction,PCR） ＊第三节 扩增片段长度多态性 （amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）

教学内容和目的要求： ＊ 1.熟悉限制性片段长度多态性分析技术及原理（RFLP）、 DNA指纹的概念、原理、基本技术。 ＊ 2.掌握扩增片段长度多态性分析技术（Amp-FLP）、聚合酶 链反应（PCR）的基本原理、PCR反应体系组成。 ＊ 3.掌握PCR-STR基因分型技术及常染色体STR、Y染色体STR分析。 学时安排：理论课 5学时。

第四章 DNA长度多态性 概述（summary） 一.发展历史 法医DNA分型的研究和应用最初是从DNA长度多态性开 始。 1.1985年Jeffreys,DNA指纹图。 2.80年代，PCR-VNTR分型技术。 2.90年代，PCR-STR分型技术。

第四章 DNA长度多态性 DNA length polymorphism ＊二.概念（Concept） 同一基因座上各等位基因之间DNA片段长度差异构成的多态性。 两个固定端点间长度的差异 重复单位

＊三.用于进行DNA长度多态性分析的遗传标记：二类 1.小卫星DNA (minisatellite DNA) 又称可变数目串联重复序列 （Variable number tandem repeats,VNTRs ） 2.微卫星DNA (microsatellite DNA) 又称短串联重复序列 （short tandem repeats,STRs）

重复单位长度 15-30bp，序列总长度约100bp-20kb。 可变数目串联重复序列 （Variable number tandem repeats,VNTRs） 重复单位长度 15-30bp，序列总长度约100bp-20kb。 基因座A(VNTR) 短串联重复序列 （short tandem repeats,STRs） 重复单位长度 2-6bp，重复次数10-60次，序列总长度多在400bp以下。 基因座B(STR)

DNA长度多态性（DNA length polymorphism)：两类 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymporphism, RFLP） 扩增片段长度多态性 （amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）

DNA指纹（DNA fingerprint）

第四章 DNA长度多态性 (DNA length polymorphism) 第一节 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymporphism, RFLP）

一.概述（summary） 限制性片段长度多态性概念： （restriction fragment length polymporphism, RFLP） 由于DNA序列中碱基的突变，导致酶切点的消失或出现新的酶切点，从而引起不同个体在用同一种限制性内切酶切时，DNA片段长度出现差异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称限制性片段长度多态性（ RFLP ）。

一.概述（summary） 、基因诊断等方面。 RFLP反映了个体间DNA核苷酸顺序的差异，并且这种差异是按照孟德尔遗传方式进行遗传。 法医物证学方面：对人类基因组中的VNTR基因座进行分型。 应用限制性内切酶和分子探针的特异性，通过DNA分子杂交技术，获得具有高度个体特异性、有多条条带组成的DNA图谱 ---DNA指纹图。

限制性片段长度多态性 (一)VNTR基因座---可变数目串连重复序列（variable （restriction fragment length polymporphism, RFLP） (一)VNTR基因座---可变数目串连重复序列（variable number tandem repeats,VNTR） （小卫星 DNA ） （二）限制性内切酶(restriction endonuclease，RE) （三）分子探针（Molecular probes）

重复单位长度 15-30bp，序列总长度约100bp-20kb。 （一）VNTR基因座---可变数目串连重复序列（小卫星DNA ） （variable number tandem repeats,VNTR） 重复单位长度 15-30bp，序列总长度约100bp-20kb。 人基因组DNA中小卫星DNA重复单位的核心序列有高度的同源性. (AACGGTCGAAGG)n (GAT AACGGTCGAAGG AA)n

（二）限制性内切酶 (restriction endonuclease，RE) 一类来源于细菌体内, 能够识别双链DNA(dsDNA) 分子中特定核苷酸序列(回 文结构)并能在识别序列内 将DNA双链切断的酶, 简称 为限制酶 。

Alu I AG CT Bam I G GATCC Hind Ⅲ A AGCTT Pst I CTCGA G 具有很好的专一性，能识别双链DNA上的特定序列－－限制性内切酶的特异性

（二）限制性内切酶(restriction endonuclease，RE) 生物学功能： 打击异己，保护自身。 降解外来侵入的DNA而不降解自身细胞的中的DNA。 因为自身DNA的酶切位点经甲基化修饰（修饰酶）而受到保护。 Why?

（二）限制性内切酶(restriction endonuclease，RE) 当用限制酶切割VNTR区时，酶切点在VNTR区的两个侧翼，就会得到各种长度不同的片段。

（二）限制性内切酶 特点：1.能识别双链DNA上的特定位点，将DNA 的双链切断。 2.在人类基因组DNA中有许多的酶切点, (restriction endonuclease，RE) 特点：1.能识别双链DNA上的特定位点，将DNA 的双链切断。 2.在人类基因组DNA中有许多的酶切点, 消化过程中所有的识别点同时被切 断，人类基因组DNA被切成许多长短不 同的DNA片段。

限制性内切酶“分子剪刀”

（三）分子探针 （ Molecular probe ） 1.根据探针的特异性分二类： 单基因座探针---DNA纹印（DNA profile） （single locus probe） 多基因座探针---DNA指纹（DNA fingerprint） （Multiple loci probe ）

（三）分子探针（ Molecular probe ） (AACGGTCGAAGG)n （1）单基因座探针（single locus probe）：具有基因座特异性，探针的碱基序列与待测基因座的等位基因片段完全互补，在高强度杂交条件下，形成单个VNTR基因座的等位基因片段(RFLP图谱)。 TTGCCAGCTTCC

（三）分子探针（ Molecular probe ） （1）单基因座探针（single locus probe） 纯合子显示一条谱带（两条长度相等的片 段），杂合子显示两条谱带（两条长度不 等的片段）---DNA纹印（DNA profile）。 单基因座探针：Pynh24，pCMM101等

DNA纹印（DNA profile）——单基因座VNTR 酶切割成不同长度的限制性片 段，经电泳分离，印迹转移,由 单基因座探针检测得到的图谱 称为DNA纹印（DNA profile）。

（三）分子探针（ Molecular probe ） （2）多基因座探针（Multiple loci probe ） VNTR基因座的核心序列具有同源性，由这类核心序列首尾相连形成多基因座探针，在低强度杂交条件下，同时可以与多个VNTR基因座等位基因形成杂交。一次可检出多个VNTR基因座。---DNA指纹（DNA fingerprint） 多基因座探针：33.6，33.15等 (AACGGTCGAAGG)n (GAT AACGGTCGAAGG AA)n

＊ DNA指纹---多基因座VNTR 将人类基因组DNA用限制性内切酶切割成不同长度的限制性片段，经电泳分离，印迹转移，用多基因座探针杂交后，获得了由多个基因座上的等位基因组成的片段长度不等的图谱，这种图谱具有高度的个体特异性，就像人类的指纹一样，故称为“ DNA指纹” （DNA fingerprint） 。

探针 探 针 设 探针：我来了！ 计 ？ 寡核苷酸： 标记物： 硝酸纤维素膜：DNA？ 如（ AGGGCTGGAGG ）18 如同位素、生物素、酶… ACTGGAGTCCTGA

（三）分子探针（ Molecular probe ） 2.探针标记（Probe mark） 在探针上连接标识分子，当探针与靶基 因片段杂交形成双链分子后，通过对标记 分子的检测就可以确定靶基因片段。

三.分子探针（ Molecular probe ） （二）探针标记(Probe mark) 标记物： 32P，生物素，荧光素，酶标记 （辣根 过 氧化酶，碱性磷酸酶）。

酶切点 分子基础 why？ 限制性片段长度多态性 点突变 插入、缺失、重复 酶切点增加 酶切点丢失

二.限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymporphism, RFLP） 限制性片段长度多态性分析有两类： 1.DNA纹印（DNA profile）：单基因座探针，单个VNTR基因座的等位基因，纯合子显示一条谱带，杂合子显示两条谱带。 2. DNA指纹（DNA fingerprint）：多基因座探针，多个VNTR基因座的等位基因，图谱由多条带组成。

基因组DNA DNA指纹基本原理 ＊ 限制性片段 不同大小DNA片段分离 DNA转移到检测膜 个体特异杂交带图纹 限制性内切酶 个体特异性取决于 限制性内切酶 探针的特异性 限制性片段 电泳分离 不同大小DNA片段分离 印迹转移 DNA转移到检测膜 小卫星探针检测 个体特异杂交带图纹

DNA指纹的基本技术 （Basic technology of DNA fingerprint）

限制性酶切 电泳分离 印迹转移 DNA 指 纹 图 基 因 组 DNA 分子杂交 DNA指纹技术基本流程

DNA指纹技术基本流程

1.基因组DNA的提取（ Genomic DNA extraction ） （一）基因组DNA的提取、纯化与定量 （Genomic DNA extraction, purification and quantitative） 1.基因组DNA的提取（ Genomic DNA extraction ） DNA提取常用方法(DNA extraction methods)

DNA提取常用方法 饱和酚-氯仿提取法 （有机法） Chelex-100法 差异裂解法 其它：磁珠法

2.基因组DNA的纯化 (Genomic DNA purification ) DNA分析通常需要高纯度的样本DNA。 残留的蛋白质、各类化学物质都可能影响 后续检测过程，降低检测的阳性率。

2.基因组DNA的纯化(Genomic DNA purification ) （1）重复用有机溶剂萃取和乙醇沉淀实验过程 （2）柱层析：Microcon100,Centricon30， Sephadex G50。 不同微孔孔径的滤膜所具有的吸附和过滤作用。

3. DNA的定量（Genomic DNA quantitative） 溴乙锭荧光检测法 (Ethidium bromide fluorescence detection method) 紫外分光光度法 (Ultraviolet spectrophotometry) 斑点杂交定量法 （Dot blot hybridization method） 荧光实时定量PCR技术 （Real time fluorescent quantitative PCR technique）

(restriction endonuclease digestion) （二）限制性核酸内切酶消化 (restriction endonuclease digestion) 能识别双链DNA上的特定位点，将DNA的双链切断。要求：限制酶活性稳定。 酶切充分。 酶的识别序列位于 VNTR序列的两个侧翼。

why? 人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。限制酶能把基因组在特异的部位切开，得到一组长度各异的片段 。

（三）电泳 electrophoresis

琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis） DNA分子是两性电解质，在pH8.0Tris-醋酸 缓冲液中带负电荷，在电场力的作用下向 正极移动，在同一电场强度下，酶切的DNA 分子从大到小在琼脂糖凝胶板上分离。 在加样时要加分子量标准物作为参照。

电泳后的琼脂糖凝胶 DNA片段已按大小分开 无法对所有片段都进行分析 琼脂糖凝胶机械强度 差

Southern转移 （四）印迹转移（ blotting） 真空转移 电转移

Southern转移 DNA is transferred to nitrocellulose

探针 探 针 设 探针：我来了！ 计 ？ 寡核苷酸： 标记物： 硝酸纤维素膜：DNA？ 如（ AGGGCTGGAGG ）18 如同位素、生物素、酶… ACTGGAGTCCTGA

根据探针的特异性 探针分二类： 单基因座探针—DNA纹印 多基因座探针—DNA指纹

探针是根据待测特定序列而设计的！ Renaturation driven by homologous base pairing Will also hybridize with a radiolabeled 5’-ACGGCTA-3’ “probe”. Renaturation driven by homologous base pairing 探针是根据待测特定序列而设计的！

探针只能与待测序列按碱基互补结合，结合是特异的

（五）分子杂交 （hybriding）

酶切片段 ＋ 探针

洗膜 杂交 曝光

二.DNA指纹图谱在法医学应用

1.符合孟德尔遗传-亲子鉴定 母 子 父

2.个体的组织同一性 血液 精液 毛发 肌肉 骨骼

3. 个体特异性 1 2 3 4 5

个人识别 ？ 认定嫌疑人 排除嫌疑人 ？ ？ ？ ？ 现场样本 嫌疑人1 嫌疑人2

DNA, the Law, and Many Other Applications – The Technology of DNA Fingerprinting A DNA fingerprint used in a murder case. The defendant stated that the blood on his clothing was his. What are we looking at? How was it produced?

亲 子 鉴 定 认定亲缘关系 母亲 孩子 可疑父亲

亲子鉴定 父 子 母

排除亲缘关系 ? ? ? ? 母亲 孩子 可疑父亲

三.DNA指纹的局限性（DNA fingerprint limitation）（自学） 1.检测灵敏度低。一次DNA指纹鉴定需要0.5～1.0μg基因组DNA，这相当于25μl 血液，5μl 精斑，0.5～1.0μg 组织或 15 根新拔除的头发。 2.对基因组DNA的要求高。用于DNA指纹分析的DNA要求高纯度，提取出的DNA分子应在20kb以上。 3.DNA指纹检测操作烦琐费时，实验周期较长。实验环节要求严格，技术不易掌握。

三.DNA指纹的局限性（DNA fingerprint limitation ）（自学） 4.多基因座探针没有种属特异性。 5.DNA指纹无基因座的特异性，不能解决混合检材的鉴定问题。 6.DNA指纹图谱的高突变率会影响亲子鉴定的结果。 7.DNA指纹图谱的统计学方法与传统的遗传统计学不同，至今还存在争议。 8.DNA指纹分析结果的表示目前无法达到标准化。