中文幻灯制作：同济医院感染科 吴迪医师 （幻灯经讲者确认） 中国慢性乙型肝炎治疗的临床需求 宁琴, MD & PhD 感染科 主任 感染性疾病研究所 所长 首届中部肝病与感染国际高峰论坛 Sep.22, 2012 各位专家，教授，今天我的报告题目是中国慢性乙型肝炎治疗的临床需求 中文幻灯制作：同济医院感染科 吴迪医师 （幻灯经讲者确认）

概要 更全面的了解中国慢性乙肝患者临床类型,如难治型 更充分的理解免疫应答和疾病进展--- 病毒清除， 感染慢性化，疾病严重度和抗病毒治疗效果 更有效的个性化治疗策略 由于抗病毒治疗的广泛运用，过去十年里中国发生HBV相关的肝硬化、原发性肝癌及慢加急性肝衰竭的风险显著降低，然而达到治疗疗效的患者比例并不理想，在中国慢性乙型肝炎的治疗仍存在以下几个临床需求尚未满足，首先我们需更全面的了解中国慢性乙肝患者的临床类型，尤其是难治型慢乙肝患者谱，第二，需要更充分的理解免疫应答与疾病进展包括病毒清除、感染慢性化、疾病严重度以及抗病毒治疗效果等之间的关系，便于更 DR. Qin Ning China

慢性乙型肝炎防治指南的进展 APASL 2012 15 EASL 201216 2000 2001 2003 2004 2005 2006 2007 2004 2006 2008 2003 2000 2009 2010 2012 APASL1 AASLD2 Chinese14 AGA10 APASL11 AASLD9 AGA8 APASL7 AGA5 AASLD6 EASL4 APASL3 APASL 2012 15 EASL13 AASLD12 EASL 201216 1. APASL working party. J Gastroenterol Hepatol 2000;15:825–841; 2. Lok AS & McMahon BJ. Hepatology 2001;34:1225–1241; 3. Liaw YF, et al. Liver Int 2005;25:472–489; 4. The EASL Jury. J Hepatol 2003;39:S3–S25; 5. Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2004;2:87–106; 6. Lok AS & McMahon BJ. Hepatology 2004;39:857–861; 7. Liaw YF, et al. Liver Int 2005;25:472–489; 8. Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2006;4:936–962; 9. Lok AS & McMahon BJ. Hepatology 2007;45:507–539; 10. Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2008;6:1315–1341; 11. Liaw YF, et al. Hepatol Int. 2008;2:263–283; 12. AASLD practice guidelines. Chronic hepatitis B: Update 2009. Available at http://www. aasld.org/practiceguidelines/Documents/Bookmarked Practice Guidelines/Chronic_Hep_B_Update_2009 8_24_2009.pdf (Feb 2012); 13. EASL Jury. J Hepatol 2009;50:227–242; 14. J Clini Hepatol, January 2011,Vol.27, No.1; 15. 2012 APASL CHB Guidelines Hepatol Int 2012; 6:531–561. 16. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.jhep.2012.02.010;

核苷（酸）类似物耐药率 LVD1 ADV1 LdT2,3 – TDF4 ETV5 3 year 1.2% 55% 11% 4 year 71% 18% 2 year <1% 0% 46% 3% 25% 1 year 23% 5% 5 year 80% 29% 6 year 1. Locarnini S. Hepatology International 2008;2:147-151；2. Lai CL, et al. New England Journal of Medicine 2007;357:2576–2578； 3. Liaw YF, et al. Gastroenterology 2009;136:486–495. 4. Snow-Lampart A, et al. HEPATOLOGY, Vol. 53, No. 3, 2011； 5. Brett-Smith H, et al. 44th EASL,2009,Abstract 20；

series registration clinical trails 目前应用于临床的抗HBV药物治疗的有效率 Treatment Efficacy with Current available Medications HBV DNA<300Copies/mL HAI improvement ALT normalization HBeAg conversation HBsAg disappear HBeAg + HBeAg - 38 62 68 72 65 74 25 44 21 60 80 39 75 61 77 79 78 63 73 64 90 88 95 48 66 70 67 27 12 22 3 <1 1.5 Adapted from series registration clinical trails

中国慢乙肝患者的特殊性 多数患者在早年感染 HBV基因型多为难治型 农村地区患者不合理的治疗经过 重症肝炎及终末期肝病多见,包括HAV和HEV的重叠感染 农村医疗保险制度的不完善,导致患者依从性下降

经治和难治型慢性乙肝患者谱 原发性无应答、部分病毒学应答、治疗期间病毒突破、或出现HBV耐药变异株的患者； 未发生e抗原血清学转换（就e抗原阳性患者而言）； 基线时高病毒载量； 发生肝硬化、重型肝炎或慢加急性肝衰竭的患者； 其他情况包括重叠感染其他病毒、胰岛素抵抗等等

概要 更全面的了解中国慢性乙肝患者临床类型,如难治型 更充分的理解免疫应答和疾病进展--- 病毒清除， 感染慢性化，严重度和抗病毒治疗与免疫应答 更有效的个性化治疗策略 DR. Qin Ning China

急性乙肝患者的HBV特异性CD4和CD8+T细胞 应答强于慢性乙肝患者 Acute HB CHB 50 40 30 20 10 60 45 15 Specific lyses% 在急性乙肝中，HBV核心抗原特异性CD4细胞应答非常强烈，从而导致病毒清除依据急性患者的恢复，然而在慢性乙肝中，我们可以看到CD4细胞应答减弱 那么CD8细胞应答的情况呢？同样在急性乙肝中，针对HBV多聚酶、X、核心及包膜蛋白特异性的CD8T细胞不同程度的增强，从而帮助清除病毒甚至导致疾病的而恢复，而在慢性乙肝中，特异性CD8T细胞的应答减弱甚至消失，导致了病毒的持续感染。 Ferrari C et al. J Immunol. 1990; Penna A et al. J Exp. Med. 1991; Bertoletti A et al. Proc. Natl.Acad. Sci. USA,1991; Rehermann B et al. J Exp. Med. 1995; Jung C et al. Virology 1999;Maini et al. J Exp. Med. 2000 9 9

慢乙肝患者非活动期体内 HBV 特异性 CD8+T 细胞功能获得重建 免疫重建 W/normal ALT，HBV DNA<105cp/ml 免疫耐受 w/normal ALT，HBV DNA>106cp/ml Liver PBMC Liver PBMC Tc 18-27 在非活动期的慢性乙肝病人肝内HBV特异性的CD8＋T细胞出现频率较高，其绝对数与大量浸润的活动性肝炎相近，对HBV抗原应答产生有效的CD8+T细胞增殖以及IFN 对HBV抗原应答产生有效的CD8+T细胞增殖以及IFN 对HBV抗原应答不产生有效的CD8+T细胞增殖以及IFN CD8+ Maini et al., J Exp Med 2000; 191:1269-80

HBV 持续感染 两种亚群的树突状细胞的功能均出现明显缺陷 TLR2表达减少 CD4+ CD25+ T细胞 (调节性T细胞)增多 PD-1分子或其配体 (PD-L1 和PD-L2) 表达增加 HBV特异性CD8+ T细胞应答减弱, 同时发生Th1 向Th17的应答转化 有研究结果提示慢性乙型肝炎患者树突状细胞的功能受损。与健康人相比，虽然髓样树突状细胞及浆细胞样树突状细胞的数量无明显差异，但是髓样树突状细胞共刺激分子的表达水平下降及分泌肿瘤坏死因子(TNF)O【减少。浆细胞样树突状细胞分泌干扰素(IFN)o【的能力下降 ，HBV可以抑制TLR的表达和功能。TLR2表达下降，干扰宿主对HBV的识别，从而逃避宿主的天然免疫应答，导致病毒的持续感染。 与健康人相比，慢性乙型肝炎患者中CD4+CD25+T淋巴细胞比例升高，且与HBVDNA载量相关U5-17]。而基于磁珠分选的功能学研究表明，CD4+CD25+T淋巴细胞在体外可以调控HBV抗原特异性CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞的增殖115，17。91。HBcAg可以刺激CD4+CD25+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞分泌IL一10；当共培养二者时，加入抗IL一10抗体可以促进T淋巴细胞向Thl分化【191。也有报道显示，肝脏内CD4+CD25+T淋巴细胞、FOXP3+细胞的比例与肝脏损伤程度呈正相关118l。 CD8+T淋巴细胞功能受损体现在以下几个方面：对抗原刺激的低反应性、分泌IFN y减少和杀伤能力的减弱【14I。而影响CD8+T淋巴细胞功能的分子机制为：共刺激分子程序性死亡受体．1的高表达和凋亡前分子Bim的上调可以抑制CD8+T淋巴细胞的功能123·241。 1. van der Molen RG et al. Hepatology 2004. 2. Riordan SM et al. Clin Vaccine Immunol 2006. 3. Maini M et al. J Exp Med 2000. 4. Boettler T et al. J Virol 2006. 5. Stoop JN et al. Hepatology 2005. 6. Ge, J. et al. J. Clin. Immunol. 2009.

巨噬细胞表达的fgl2在病毒诱导的重型肝炎 的肝损害中发挥重要作用 N-terminal Procoagulant C-terminal Activated reticuloendothelium 凝血酶原 凝血酶 纤维素原 Ning Q et al .. Gary Levy. J Immunology 1998, Marsten P, Ning Q, et al….Gary Levy. J Clin Invest 2003 Ning Q. J Immunology 2006. Zhu CL.. Ning Q. Human Gene Therapy 2005. Gao S… Ning Q. Human Gene Therapy 2010. 微环境中 纤维素的沉积

An unidentified protein HBV通过依赖 c-Ets-2和MAPK 信号途径诱导的hfgl2转录 Extracelluar matrix Cytoplasm HBx + HBc JNK + An unidentified protein + ERK + Signal molecules c-Ets-2 c-Ets-2 HBx与HBc蛋白通过 c-Ets-2 与 MAPK信号途径诱导hfgl2基因的高表达 HBV野生株编码蛋白C和X蛋白分别激活ERK 和JNK信号途径，继而激活转录因子c-Ets-2，使之转位至核内，与hfgl2基因启动子上相应顺式作用元件结合激活该基因的表达，阐明了HBV诱导的hfgl2基因表达的详尽分子机制。 421。我们进一步研究了hfgl 2基因的 调控机制和网络。发现HBc蛋白和HBx蛋白均具 有激活hf91 2的功能，而HBs蛋白则不能激活该 基因；系列启动子缺失试验表明：在hfgl 2基因启 动子一712—一568位(相对于转录起始点)之间存在 着激活该基因的调控序列，在病毒蛋白作用下，转 录因子c—Ets一2能与hf912基因启动子上相关顺式作 用元件结合，从而激活该基因的表达；重型乙型肝 炎患者的P-JNK以及P—ERK的磷酸化水平较健康对 照者明显增强，提示重型肝炎患者JNK及ERK信号 传导途径被激活。体外实验结果显示，在病毒蛋白 HBx及HBc作用下，信号传导途径JNK及ERK分 别被激活，c．Ets．2的表达及转位与JNK及ERK的活 性有关。以上结果说明，乙型肝炎病毒蛋白HBc及 HBx分别通过激活JNK途径及ERK途径，继而激活 转录因子c—Ets一2，使之移位至核内，并与hf912基因 启动子上顺式作用元件结合从而上调hfgl2基因的 表达【431。 Nucleus Hfgl2 mRNA hfgl2 Hfgl2 mRNA Han MF… Ning Q. J Biol Chem . 2008 13

HBs突变子通过转录因子Ets激活hfgl2表达 Cell membrane hGFL2 HBs Mut1: rtM204V/sI195M or HBs Mut2: rtM204I/sW196L HBs Mutant Translation Ets HBs突变株通过激活转录因子ETS，使其移位到细胞核内，与fgl2启动子上相应结合位点结合，激活fgl2基因的转录复制 Translocation Cytoplasm Ets Transcriptional Activation of hfgl2 hfgl2 mRNA Nucleus Li WN… Ning Q. Biochemistry 2011 epub ahead

病毒诱导的肝衰竭中肝内NK细胞通过Fas/FasL以及NKG2D/ NKG2DL途径导致肝细胞损害 spleen NK BM HBV/ACLF MHV-3/FHF Chemokines ？ PB 我们用重型肝炎患者标本和3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠重型肝炎模型探讨了自然杀伤细胞NK的作用。我们在临床样本中分别检测了15例轻、中度慢性乙型肝炎患者和14例慢加急性乙型肝炎肝功能衰竭患者外周血自然杀伤细胞NKP30、NKG2D和Fas配体的表达情况，发现这几种与NK活化及功能相关的分子在慢加急性乙型肝炎肝功能衰竭患者的表达水平均显著高于轻、中度慢性乙型肝炎患者(表达比例和荧光强度)，这提示NK在慢加急性乙型肝炎肝功能衰竭的发生和发展过程中有着重要作用。进一步研究表明小鼠感染MI'／V-3后，来自骨髓和脾脏的NK迅速在肝脏大量募集、活化，并与小鼠肝脏损伤的严重程度呈正相关。病毒感染后肝脏NK分泌1FN Y、TNF 水平也显著增加。肝脏NK对YAC一1及MHV-3感染肝细胞的细胞毒活性显著增强，主要通过激活Fas．Fas配体途径、NKG2D—NKG2D配体途径对病毒感染肝细胞发挥杀伤作用。 Zou Y ..Ning Q J Immunology 2010

CD4-CD8-DN T细胞通过高表达mfgl2以及 Wu D…Ning Q. Unpublished data 通过活化NK细胞共同导致肝损害 Wu D…Ning Q. Unpublished data MHV-3 mfgl2 expression and fibrin deposition Liver ALF DN T CD69 CD69 TNF-α IFN-γ NK migration TNFR2 Spleen DN T phenotype：CD3+CD4-CD8-CD25- CD28-CD30-D44+ with TCRαβ+ 63.6%，TCRγδ+ 20.3% Cytokines：11.7% produce IL-2，not robust for other cytokines

2010. 1478-3223 HBV Ning Q et al J Immunology 1998, Ning et al. J Bio Chem 1999, Ning et al. J Bio Chem 2003， Marsten P, Ning Q, et al J Clin Invest 2003, Han MF..Ning Q. J Bio Chem 2008, Zhu CL,.. Ning Q et al. Human Gene Therapy 2006 , Gao S… Ning Q. Human Gene Therapy 2010. Zhou Y..Ning Q. J Immunology 2010.

Ning et al. Short Report. Exploring Difficult to Treat Chronic Hepatitis B. Science (supplement) 2011. P42-43 Figure 1. 肝炎病毒诱导的及免疫介导的肝损害可能的机制

PegIFN alpha 应答患者肝内CD8+T细胞增多 responders nonresponders Fig. 5. The course of the relative numbers of total CD8C T-lymphocytes, CD8CGrBC T-lymphocytes and CD8CIFNgC T-lymphocytes before, during and at the end of therapy in FNAB of responders (left panels) and non-responders (right panels). The values during therapy which are depicted are the peak value observed either at week 2 or week 8 of therapy. Means are depicted with bars. (*Zbaseline vs. peak: P!0.05). Journal of Hepatology 43 (2005) 45–52 19 19

e抗原阳性患者，LDT/LAM对HBV复制的强效抑制与HBV特异性T细胞上PD-1表达下调密切相关 Infected Hepatocyte MHC I PD-1 PD-L1 Exhausted Virus-specific CD8+ T-cell HBV-specific CD8 + T-cells p = 0.01 近期研究结果表明替比夫定治疗获得HBeAg阴 转或HBeAg／抗一HBe血清学转换的患者，其CD8+T 淋巴细胞上PDl分子的表达水平显著下降[51】 HBV DNA levels % of PD1 + cells Evans A. et al., Hepatology 2008

获得e抗原血清学转换的患者HBV特异性T细胞PD-1的表达进一步减少 Evans A. et al., Hepatology 2008 替比夫定治疗获得HBeAg阴 转或HBeAg／抗一HBe血清学转换的患者，其CD8+T 淋巴细胞上PDl分子的表达水平显著下降[51】 Seroconverters, N=6 Non-Seroconverters, N=12 Evans A. et al., Hepatology 2008

概要 更全面的了解中国慢性乙肝患者临床类型,如难治型 更充分的理解免疫应答和疾病进展--- 病毒清除， 感染慢性化，严重度和抗病毒治疗与免疫应答 更有效的个性化治疗策略 DR. Qin Ning China

中国目前正在进行的相关临床研究 OSST 研究 Climber 研究 Dragon 研究 …..

经治和难治型慢性乙肝患者谱 原发性无应答、部分病毒学应答、治疗期间病毒突破、或HBV耐药变异株出现的患者； 未发生e抗原血清学转换（就e抗原阳性患者而言）； 基线时高病毒载量； 有肝硬化、重型肝炎或慢加急性肝衰竭的患者； 其他情况包括重叠感染其他病毒、胰岛素抵抗等等

一项关于提高e抗原阳性患者采用pegIFN-2a和ETV联合序贯治疗以提高HBeAg/HBsAg 阴转率/血清学转换的IV期临床研究 (中国OSST研究的最终结果) 将于2012.11.13 AASLD在主会场上发表口头汇报

OSST 研究设计 随机化、开放、多中心研究 治疗终点：e抗原转阴/血清转换，s抗原转阴 (n=100) Switch to PegIFN 180 µg 48W (n=100) HBV DNA <103cp/mL qHBeAg < 100 PEIU/mL ETV （0.5mg Qd） 8W ETV (0.5mg Qd) (N=200) 1-3 years ETV 0.5mg Qd 48W (n=100) 随机化、开放、多中心研究 治疗终点：e抗原转阴/血清转换，s抗原转阴 Randomization 1:1 26

患者基线特征 PEGASYS N=53 ETV N=49 P value 77.4 87.8 0.1688 32.9 31.3 0.3340 Males (%) 77.4 87.8 0.1688 Age, mean (years) 32.9 31.3 0.3340 Quantitative HBsAg: (log10 IU/ml) Mean (SD) 3.31 (0.53) 3.25 (0.56) 0.3821 HBV DNA by PCR: (log10 c/ml) Mean (SD) 3.04 (0.16) 3.01 (0.04) 0.1974 ALT (U/L): mean (SD) 29.2 (24.6) 23.6(10.5) 0.1409 Quantitative HBeAg: （PEIU）Mean (SD) 7.49 (15.38) 7.92 (15.58) 0.5817

治疗48周e抗原阴转和血清学转换 PegIFN (n=53) ETV (n=49) 72% 63% Patients (%) 15% 6% References: BARACLUDE™ (entecavir) Prescribing Information, 2005, Bristol-Myers Squibb Company. BMS data on file. 6% 32/49 8/53 38 /53 7/49 WEEK 48 28 28 28

治疗48周s抗原阴转和血清学转换 PegIFN (n=53) P < 0.05 ETV (n=49) 13% Patients (%) 6% Reference: BARACLUDE™ (entecavir) Prescribing Information, 2005, Bristol-Myers Squibb Company. BMS data on file. 7/53 3/53 WEEK 48 29 29 29

总结 经过ETV达到病毒学控制的患者加用PegIFN-alpha2a是达到e抗原血清学转换和s抗原高阴转率的潜在治疗措施 该研究中继续使用ETV的患者未发生s抗原阴转 治疗48周后维持应答的时间需进一步观察 患者动态的免疫学状态目前正在分析中

Climber 研究 多中心、前瞻性、开放性研究 E+ CHB High VL screening 4 weeks Group I LAM 100mg Qd + ADV 10mg Qd n=120 Group II ETV 0.5mg Qd n=120 12w 36w 48w 60w 72w 84w 24w Baseline 96w 多中心、前瞻性、开放性研究 比较恩替卡韦单药治疗和拉米夫定/阿德福韦酯联合治疗高病毒载量e抗原阳性慢性乙型肝炎患者的疗效、安全性和耐药

partial viral response CHB Dragon 研究 ETV 1.0mg ETV 0.5mg + ADV 10mg Weeks 52 104 (1:1:1) NA partial viral response CHB 随机、开放 (N=360) ETV 1.0mg + ADV 10mg 评估三种抗病毒治疗策略的疗效和安全性

要点 有限的治疗手段和方案导致经治和难治型慢乙肝患者增多 机体免疫应答是影响HBV病毒清除、感染慢性化、疾病严重度， 抗病毒治疗和免疫调节治疗的联合应用是治疗 慢乙肝患者的新希望 DR. Qin Ning China

致谢 同济医院 国际合作者 Dr. Han, Meifang Prof. Gary Levy Dr. Chen, Tao Dr. Xi, Dong Dr. Yan, Weiming Dr. Wang, Xiaojin Dr. Wu, Zeguang Dr. Zhu, Chuanglong Dr. Zou, Yong Dr. Wang, Ming … 国际合作者 Prof. Gary Levy 经费来源 NSFC MOST MOH MOE 34

致谢 PIs (site list) Prof. Qin Ning, Wuhan, TongJi Hospital (Leading PI, Central EC) Prof. Jinlin Hou, Guangzhou, Nanfang Hospital Prof. Yongtao Sun, Xi’an, TangDu Hospital Prof. Deming Tan, Changsha, Xiangya Hospital of Centre-south University Prof. Jiaji Jiang, Fuzhou, The first Affiliated Hospital of Fujian Medical University Prof. Hong Tang, Chengdu, West China Hospital Prof. Jifang Sheng, Hang Zhou, The First Affiliated Hospital of Medical School of Zhejiang University Patients Roche Pharmaceutical BMS

致谢

Tongji Hospital, Wuhan CHINA 同济医院 中国武汉 Tongji Hospital, Wuhan CHINA