化学生物学综合实验六 酪氨酸酶抑制及激活作用动力学的分析 指导教师：马林 化学与化学工程学院

一、实验基本原理 酪氨酸酶(Tyraseosinase，Tyrase)又称儿茶酚氧化酶(Ec.1.14.18.1)属于多酚氧化酶（漆酶和二酚氧化酶）中的一种。它广泛存在于红薯、香蕉、苹果、蘑菇、马铃薯及人体等动植物中，也存在于微生物，特别是霉菌之中。 在动植物体内，酪氨酸酶对酪氨酸和其它酚类化合物的代谢以及黑色素的合成起重要的催化作用。酪氨酸酶可以催化两类不同的反应：单酚羟基化形成邻二酚和邻苯二酚氧化成邻醌，这两类反应都必须有氧分子的直接参与。

黑色素形成机制 对黑色素细胞内的黑色素形成机理的研究表明，黑色素的形成主要是由黑色素细胞内的四种酶：酪氨酸酶､多巴异构酶、过氧化物酶、等酶单独或协同作用的结果。 大量的研究表明，黑素细胞内黑色素的生物合成是一个由酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列生化反应：体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸即多巴，多巴进一步氧化生成多巴醌，多巴醌经多聚化反应与氧化反应生成多巴色素，在多巴色素异构酶 作用下, 多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸, 脱羧成 5,6-二羟基吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后与其它中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前部分-由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致, 但在以后的反应中有半胱氨酸参加, 产生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通过关环､脱羧, 最后形成脱黑色素。

酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶，它不仅决定黑素合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志，因此它给人体皮肤美白带来困难。酪氨酸酶的活性与黑素合成量相关，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄褐斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义。 酪氨酸酶的底物结合部位，由于铜原子与氧的结合部位关系密切，故凡能与铜原子形成复合物的化学试剂均有可能是酶的有效抑制剂。苯甲酸、叠氮化物、氰化物、苯硫脲和半胱氨酸等对O2与酶结合有竞争作用；非酚类芳香族化合物对底物与酶结合有竞争作用。近些年来，人们从植物中分离出多种酪氨酸酶抑制剂用于化妆品工业，如熊果苷、曲酸、根皮素等。

二、实验过程 酶抑制剂的高通量筛选可以通过酶标仪进行，但系统地、准确地研究抑制剂的IC50以及抑制作用的动力学必须通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分光光度计测试几种化合物对马铃薯多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制和激活作用的动力学。 实验材料： 马铃薯酪氨酸酶粗酶（前面实验提取） 抑制剂：硫酸亚铁、六羟基二苯甲酮、2-萘酚 激活剂：1-萘酚、硫酸铜、二羟基二苯甲酮

实验仪器和条件 实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二酚 化合物溶液的配制： 北京普析通用UV-1901 紫外可见分光光度计 实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏水配成50mol/L。

实验安排 2，测试体系 在总计1000L的测试体系中，加入920或930L 1，酶催化条件探索 由于每次实验得到的粗酶液酶催化活性不同，所以在测试过程中，需要探索实验中所使用的酶的剂量。 本实验要求测试的酶催化活性-每分钟OD值变化在0.1-0.13范围内。本实验采用调节酶液用量的方式。 2，测试体系 在总计1000L的测试体系中，加入920或930L 0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液，10L样品溶液（以10 L缓冲液或乙醇做对照），10-20L粗酶液，室温放置20分钟，立即加入50L 25mol/L 邻苯二酚溶液， 390nm进行时间扫描，记录1分钟的OD值。

实验安排 3，抑制剂IC50的测试 改变样品溶液的剂量，分别测试酶催化活性。可以通过稀释的方式改变样品的浓度。 以没有加入样品的酶催化活性OD/min值为100%，用抑制百分数(指被抑制而失去活力的百分数)表示不同浓度样品对酶的抑制活性，作图求出抑制50%时样品的浓度。

实验安排 4，抑制剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓度，以及没加样品三个系列，改变底物溶液的剂量，分别测试酶催化活性。 以底物浓度（mol/L）倒数1/[S]对酶催化活性OD/min值的倒数1/V作图，根据三条线的交点判断抑制剂的类型。

实验安排 5，激活作用的测试 改变样品溶液的剂量，分别测试酶催化活性。可以通过稀释的方式改变样品的浓度。 以没有加入样品的酶催化活性OD/min值为100%，用激活百分数(指被激活而增加活力的百分数)表示不同浓度样品对酶的激活活性，作图求出最大激活活性时样品的浓度。

实验安排 6，激活剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓度，以及没加样品三个系列，改变底物溶液的剂量，分别测试酶催化活性。 以底物浓度（mol/L）倒数1/[S]对酶催化活性OD/min值的倒数1/V作图，根据三条线的交点判断抑制剂的类型。

三、实验报告 采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几个点得到比较理想的曲线。 两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行分析，按照研究论文形式写出实验报告。 2 实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实验结果，如果可能结合起来一起进行分析。 3

四、实验注意事项 实验中，需要细心，要正确使用移液器 1. 一次性比色皿有方向性，使用时要注意 2. 实验结果分析、讨论须有自己的论点 3.