1 No.3 血清总蛋白含量的测定 by:煜.明.奇.婷.远
2 实验目的 1. 熟悉血清总蛋白的测定方法（双缩脲法） 2. 掌握血清总蛋白测定的临床意义
血清总蛋白 3 球蛋白 35~50g/L 血清蛋白 白蛋白 20~40g/L
蛋白质含量测定的几种方法 4 方法 灵敏度 时间 原理 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正
双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 耗费时间长；操作要严格计时； 5 方法 灵敏度 时间 原理 说明 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ≈5g 慢速 40～60 分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1～5g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定；
6 凯氏定氮法（图）
7 凯氏定氮法 浓硫酸 +OH- 样品中的有机氮 无机铵盐 NH3 催化剂 根据酸的增重算出样品中氮的含量 用酸吸收
紫外吸光光分度计 8
Folin－酚试剂 9
10 考马斯亮蓝
实验原理 11 双缩脲试剂 双缩脲+双缩脲试剂 紫红色络合物
相似的 12 紫红色络合物 肽键+双缩脲试剂 血清总蛋白的吸光度在一定浓度范围内和样品中蛋白质的浓度成正比，同蛋白质标准液比较后，即可求得蛋白质的量。
注意！ 1.双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反应！ 2.凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨基（-CONH2-） 均可呈双缩脲反应。 如： 13 1.双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反应！ 2.凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨基（-CONH2-） 均可呈双缩脲反应。 如： 3HCCONH NHCOCH3
实验试剂 1.生理盐水：NaCl 0.9g 溶于100ml蒸馏水 14 1.生理盐水：NaCl 0.9g 溶于100ml蒸馏水 2.双缩脲试剂：硫酸铜 3.0g溶于500ml蒸馏水，加酒石酸钾钠9.0g,碘化钾5.0g，完全溶解后，加入24%NaOH100ml，用蒸馏水稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。 3.蛋白质标准液：收集混合血清，经凯氏定氮法定值，用作蛋白质标准液。贮于冰箱中备用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替代。 4.待测血清用生理盐水1:10稀释。
注意 15 收集的血清要求无黄疸，无溶血，乙型肝炎表面抗原阴性，肾功能正常。 黄疸 溶血 乙型肝炎
WHY ? 血清蛋白质是各种蛋白的复杂混合物，含有 白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原等 16 血清蛋白质是各种蛋白的复杂混合物，含有 白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原等 黄疸：肝功能不正常；（肝脏是合成蛋白质的重要场所） 溶血：如红细胞中的血红蛋白被释放到血液中，使测量值偏大
实验操作 取3支试管，按下表操作： 测定管 标准管 空白管 血清（ml） 1.00 — 蛋白质标准液（ml） 生理盐水（ml） 17 取3支试管，按下表操作： 测定管 标准管 空白管 血清（ml） 1.00 — 蛋白质标准液（ml） 生理盐水（ml） 双缩脲试剂（ml） 5.0 混匀，37度水浴10分钟，以空白管调零，540nm波长处进行比色，分别读出各管的吸光度。
计算公式 根据 得 = A测/A标 C=A/E 血清总蛋白浓度 蛋白质标准液浓度 血清总蛋白含量=浓度X稀释倍数 18 根据 C=A/E 血清总蛋白浓度 = A测/A标 蛋白质标准液浓度 血清总蛋白含量=浓度X稀释倍数 得 血清总蛋白含量=（A测/A标）X蛋白质标准液浓度X稀释倍数
临床意义 1.清总蛋白增高： ①血液浓缩：腹泻、呕吐等。 ②合成增加：如多发性骨髓瘤等。 2.清总蛋白降低： 19 1.清总蛋白增高： ①血液浓缩：腹泻、呕吐等。 ②合成增加：如多发性骨髓瘤等。 2.清总蛋白降低： ①血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因引起的水钠潴留。 ②摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。 ③合成障碍：肝脏疾病。 ④蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。
注意事项 1.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原。 20 1.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原。 2.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示。 3.高脂，黄疸及溶血标本应做血清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。 4.在浓度小于100g/L时呈良好的线性关系。