第三章 药用动物活性成分类型与提取方法 1动物药活性成分类型 2动物药有效成分的提取,分离技术

第一节 动物药活性成分类型 1蛋白质（酶）、多肽及氨基酸类 蚯蚓中蚓激酶能降解纤维蛋白原; 蛇毒蛋白酶、蛇毒酶等用于血栓治疗； 动物尿液中的尿激酶、激肽释放酶以及胰脏中提取的弹性蛋白酶等用于治疗心血管疾病； 哺乳类动物和鸟类的脏器及豚鼠血清中的天门冬酰胺酶、精氨酸酶等临床用于治疗肿瘤 ;

糖蛋白，如圆蛤中蛤素具有抗肿瘤、抗病毒活性； 中华大蟾蜍的糖蛋白具有强心利尿作用； 。

五谷虫(大头金蝇Chrysomyis megacephala(Fab.))胰蛋白酶、肠肽酶有助消化作用； 蝮蛇毒中分出的以精氨酸酶用于治疗脑血栓及血栓闭塞性动脉炎有效。

毒肽如眼镜蛇毒主要用于晚期转移癌痛、神经痛、风湿性关节痛、偏头痛等顽固性疼痛； 蜂毒肽有强溶血作用和表面活性，能阻碍肌肉神经间的传导；

水蛭素具有抗凝血作用和溶解血栓的作用； 蚯蚓中分得一种分子量为510.8Da的短肽具有抗菌活性； 海绵动物、软体动物、昆虫及两栖动物皮肤中的抗生肽也用于抗细菌和病毒；

氨基酸 :地龙的解热作用与其氨基酸含量成正比； 紫河车(人胎盘)的氨基酸提取物对白细胞减少症有一定治疗作用； 牛黄(牛胆囊结石)的牛磺酸有刺激胆汁分泌和降低眼压作用 .

2生物碱类 蛤蚧及全蝎中的肉毒碱，为氨基酸衍生物，能防止室性心律不齐； 河豚卵巢中的河豚毒素，属胍类衍生物，毒性极强，阻断轴突传导作用比可卡因强16万倍，并有松弛肌肉痉挛、减轻晚期癌痛的作用；

动物胆汁中得到的胆红素属吡咯衍生物，有促进红细胞新生、血清抗炎、治疗肝硬变作用； 蟾蜍色胺属吲哚类生物碱；箭毒蛙所含的哌啶类生物碱能麻痹骨骼肌；

乌贼墨主要成分黑色素有止血作用； 地龙的次黄嘌呤有抗组胺、平喘、降压作用

3多糖类 动物各种组织中的肝素用于抗凝； 甲壳动物和昆虫体壁外的甲壳素用于抗菌抗辐射； 棘皮动物粘多糖具抗癌和抗凝血酶活性；鲨鱼及深海软骨鱼骨骼所含杂多糖，具有显著的肿瘤抑制作用； 软体动物中所含葡聚糖被证实具有较好的抗肿瘤活性。

4甾体类 甾体类化合物在药用动物中广泛分布，化学结构变化多，生物活性多样，如性激素、胆汁酸、蟾毒、蜕皮素及甾体皂苷等。

性激素或性信息素的有紫河车中的黄体酮、鹿茸中的雌酮、海狗肾中的雄甾酮等。

动物胆汁中发现的胆汁酸有近百种，常见的有胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸等。去氧胆酸解痉作用明显；熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸能溶解胆结石; 昆虫蜕皮激素有促进人体蛋白质合成，排除体内胆甾醇，降低血脂和抑制血糖上升等作用; 蟾毒甾体有强心作用;

棘皮动物的海参纲及海星纲均含皂苷，如梅花参中的梅花参素A、B，刺参中的刺参素A、B、C以及多棘海盘车中的海星皂苷等，这些皂苷一般能抑制癌细胞的生长，并有抗真菌、抗辐射、增强白细胞吞噬的功能。

5萜类 斑蝥素为芫菁科昆虫分泌的单萜类防御物质，具抗癌、抗病毒、抗真菌作用； 腔肠动物海鞭的pseudopterosins，为二萜糖苷类化合物，具有很强的消炎止痛作用.

鲨鱼肝所含鲨烯是杀菌剂，并具有抗癌活性； 海绵属动物含有的环烯醚萜类成分有抗白色粘球菌作用等

6酚、酮、酸类 海绵所含酚类成分siphonodictyal-A及siphonodictyal-B具有抗菌活性； 麝香中的麝香酮有强心、抗炎、兴奋呼吸和中枢神经的作用；

地龙中的花生四烯酸有解热作用； 胆汁酸有利胆、溶解胆结石、镇咳祛痰、解热、抗菌抑癌等多种功用； 蜂王浆中的王浆酸有抗菌、抗肿瘤作用。

第二节 动物药有效成分的提取 一、溶剂提取法 原理： 1相似相溶 2扩散作用 技术要求: 粉碎 防霉

溶剂的选择 选择溶剂要注意以下三点： ①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小； ②溶剂不能与中药的成分起化学变化； ③溶剂要经济、易得、使用安全等。

常见的提取溶剂 1）水： 水是一种强的极性溶剂。 中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出。 为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。酸水提取，可使生物碱与酸生成盐类而溶出，碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分溶出。

问题: 易霉坏变质 ; 沸水提取时，中草药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难 ; 提取液中含有皂甙及粘液质类成分，在减压浓缩时，还会产生大量泡沫，造成浓缩的困难。

2)亲水性的有机溶剂： 如乙醇、甲醇、丙酮等， 以乙醇最常用。 对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。 甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低（64℃），但有毒性，使用时应注意。

亲脂溶剂 石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。 这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提取亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。 如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分.

提取方法 常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等

1）浸渍法： 将中草药粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。

2）渗漉法： 将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法，当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。

渗漉器

注意事项 但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀渗液作为另一批新原料的溶剂之用。

3）煎煮法 是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。

煎煮器

4）回流提取法： 应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾一定的时间，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。

回流提取装置

5）连续提取法 应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。

二、 水蒸气蒸馏法 适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中药成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上，与水不相混溶或仅微溶，且在约100℃时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时，液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出。

水蒸气蒸馏装置

中草药中的挥发油，某些小分子生物碱一麻黄碱、槟榔碱，以及某些小分子的酚性物质。牡丹酚等，都可应用本法提取。 有些挥发性成分在水中的溶解度稍大些，常将蒸馏液重新蒸馏，在最先蒸馏出的部分，分出挥发油层，或在蒸馏液水层经盐析法并用低沸点溶剂将成分提取出来。例如玫瑰油、原白头翁素等的制备多采用此法。

三、升华法 固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。 中草药中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自中草药中提取出来。 例如樟木中升华的樟脑（camphor）。 茶叶中的咖啡碱在178℃以上就能升华而不被分解。 游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类，有机酸类成分，有些也具有升华的性质。例如七叶内酯及苯甲酸等。

升华装置

四、分离和纯化 可采用的方法: 溶剂分离法 两相溶剂萃取法 沉淀法 盐析法 透析法 结晶、重结晶和分步结晶法 层析法 超临界CO2流体萃取技术

1溶剂分离法(萃取) 原理: 总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离 要求: 选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离 .

例如: 防己乙醇浸膏，碱化后可利用乙醚溶出脂溶性生物碱，再以冷苯处理溶出防己碱，与其结构类似的防己诺林碱比前者少一甲基而有一酚羟基，不溶于冷苯而得以分离.

水浸膏或乙醇浸膏常常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌于适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取 .

水提液中常含有树胶、粘液质、蛋白质、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使这些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出，而达到与其它成分分离的目的 . 水提取液中获得白及胶，可采用加乙醇沉淀法； 括楼根汁中制取天花粉素，可滴入丙酮使分次沉淀析出; 提取多糖及多肽类化合物，多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法。

利用某些成分能在酸或碱中溶解，又在加碱或加酸变更溶液的pH后，成不溶物而析出以达到分离目的. 内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离 .

中草药总提取物用酸水、碱水先后处理，可以分为三部分：溶于酸水的为碱性成分（如生物碱），溶于碱水的为酸性成分（如有机酸），酸、碱均不溶的为中性成分（如甾醇）。 例如: 长春花生物碱、石蒜生物碱的分离; 紫董定碱（corydine）; 蝙蝠葛碱（dauricins）; 四氢掌叶防己碱

2 两相溶剂萃取法 原理: 利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高、如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。

分液漏斗

注意以下几点和处理： (1)出现乳化 现象 (2)水提取液的浓度最好比重 (3)溶剂与水溶液应保持一定量的比例 (4)一般萃取多次.

2 沉淀法 是在中药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。

(1) 铅盐沉淀法 分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。 常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。

脱铅方法 : 硫化氢脱铅 用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等除铅 例如: 在黄芩水煎液中加入明矾溶液，黄芩甙就与铝盐络合生成难溶于水的络化物而与杂质分离，这种络化物经用水洗净就可直接供药用。

(2)试剂沉淀法 在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂，则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出。 橙皮甙、芦丁、黄芩甙、甘草皂甙均易溶于碱性溶液，当加入酸后可使之沉淀析出。 某些蛋白质溶液，可以变更溶液的pH值利用其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀析出。

3 盐析法 是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离. 盐析的无机盐: 氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 例如: 三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可沉淀析出: 黄藤中提取掌叶防己碱，三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸胺盐析制备。

4 透析法 利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。 透析膜: 动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。常用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，小心加入欲透析的样品溶液，悬挂在清水容器中。 例如: 分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质 .

5结晶、重结晶和分步结晶法 结晶的意义: 鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中药成分制备成单体纯品。 一般来说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。 一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定 .

制备结晶 例如: 1选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂 晶 的溶剂 大黄素在吡啶中易于结晶; 一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋 作制备结 晶 的溶剂 有些化合物在某些溶剂中则易于形成结晶。 例如: 葛根素、逆没食子酸在冰醋酸中易形成结晶; 大黄素在吡啶中易于结晶; 萱草毒素在N，N一二甲基甲酰胺（DMF）中易得到结晶; 穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶; 蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。

结晶溶液的制备 制备结晶的溶液，需要成为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处。如果在室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多的杂质。 如果溶液浓度适当，温度慢慢降低，可析出结晶较大而纯度较高的结晶。 有的化合物其结晶的形成需要较长的时间，例如铃兰毒甙等，有时需放置数天或更长的时间。

制备结晶操作 1放置过程中，最好先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低。 2放置一段时间后没有结晶析出，可以加入极微量的种晶，即同种化合物结晶的微小颗粒。加种晶是诱导晶核形成常用而有效的手段。 3没有种晶时，可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴，在空气中任溶剂挥散，再用以磨擦容器内壁溶液边缘处，以诱导结晶的形成。 4如仍无结晶析出，可打开瓶塞任溶液逐步挥散，慢慢析晶。 5或另选适当溶剂处理，或再精制一次，尽可能除尽杂质后进行结晶操作。

重结晶及分步结晶 在制备结晶时，最好在形成一批结晶后，立即倾出上层溶液，然后再放置以得到第二批结晶。晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。 结晶经重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。

结晶纯度的判定 化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距可以作为鉴定的初步依据. 高压液谱、气相层析、紫外光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度。

6层析法 基本原理： 层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和离子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为气相层析，流动相为液体的称为液相层析。

柱层析装置

吸附层析法（AdsorptionChromatography） 特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分，一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等的分离 . 吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质.

吸附剂： 常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 溶剂： 在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。 洗脱剂的选择: 须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑.

被分离物质的性质： 被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。

薄层层析 薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。 主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀 .

薄层层析

8超临界CO2流体萃取技术 利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的萃取技术。 在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。 超临界CO2流体萃取过程是由萃取和分离过程组合而成的。 超临界流体萃取是70年代末发展起来的一种新型物质分离、精制技术。

超临界CO2流体萃取仪

超临界流体定义 超临界流体(Supercritical fluid，SCF)技术 　　 任何一种物质都存在三种相态-气相、液相、固相。三相成平衡态共存的点叫三相点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临界点时的温度和压力称为临界压力。不同的物质其临界点所要求的压力和温度各不相同。 超临界流体(Supercritical fluid，SCF)技术 指温度和压力均高于临界点的流体,如二氧化碳临界温度Tc=31.26℃、临界压力Pc=7.2MPa 。 高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。处于超临界状态时，气液两相性质非常相近，以至无法分别，所以称之为SCF。

处于临界点以上温度和压力区域下的流体，在临界点附近，会出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化。

超临界流体萃取分离原理 利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。当气体处于超临界状态时, 成为性质介于液体和气体之间的单一相态, 具有和液体相近的密度, 粘度虽高于气体但明显低于液体, 扩散系数为液体的10～100倍; 因此对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力, 能够将物料中某些成分提取出来。

在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分萃取出来。并且超临界流体的密度和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加, 极性增大, 利用程序升压可将不同极性的成分进行分步提取。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以通过控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则自动完全或基本 析出，从而达到分离提纯的目的，并将萃取分离两过程合为一体，这就是超临界流体萃取分离的基本原理。

二氧化碳超临界流体萃取 二氧化碳在温度高于临界温度Tc=31.26℃、压力高于临界压力Pc=7.2MPa的状态下，性质会发生变化，其密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解能力。用它可溶解多种物质，然后提取其中的有效成分，具有广泛的应用前景。

特点： 1. 可以在接近室温(35～40℃)及CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散; 2由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留的溶剂物质，从而防止了提取过程中对人体有害物的存在和对环境的污染，保证了100%的纯天然性 ;

3. 萃取和分离合二为一，当饱和的溶解物的CO2流体进入分离器时，由于压力的下降或温度的变化，使得CO2与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不仅萃取的效率高而且能耗较少，提高了生产效率也降低了费用成本； 4. CO2是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，且属于不燃性气体，无味、无臭、无毒、安全性非常好；

5. CO2气体价格便宜，纯度高，容易制取，且在生产中可以重复循环使用，从而有效的降低了成本； 6. 压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数，通过改变温度和压力达到萃取的目的，压力固定通过改变温度也同样可以将物质分离开来。

应用 1. 从药用植物中萃取生物活性分子，生物碱萃取和分离； 2. 来自不同微生物的类脂脂类，或用于类脂脂类回收，或从配糖和蛋白质中去除类脂脂类； 3. 从不同的植物中萃取抗癌物质，特别是从水松皮和树叶中获得分类衍生物防治癌症； 4. 维生素，主要是维生素E的萃取； 5. 对各种活性物质（天然的或合成的）进行提纯，除去不需要分子（比如从蔬菜提取物中除掉杀虫剂）或“渣物”以获得提纯产品； 6. 对各种天然抗菌或抗氧化萃取物的加工，如罗勒、串红、百里香、蒜、洋葱、春黄菊、辣椒粉、甘草和茴香子等物资。

思考题 1简述动物药用成分有哪些主要类型,每一类型举例说明存在于哪种动物,它的功效如何. 2简述药用成分的溶剂提取,萃取,层析和结晶的基本原理和方法,举例说明2种药用成分的提取方法.