免 疫 组 织 化 学 技 术 陈 芸

第一节 免疫组织化学技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry）或免疫细胞化学（Immunocytochemistry）是利用抗原抗体特异性结合的原理，主要用标记抗体追踪定位抗原，以确定组织和细胞中的某种化学物质。

免疫组织化学的基本原理，是用标记物或 显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。

新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。

石蜡包埋的组织固定及脱水包埋 用于石蜡包埋的组织及时取材后应立即置于适当的固定液中，组织块不宜过大，以免固定剂及其以后处理过程中液体不宜穿透组织，一般为1×1×0.3cm大小。

固 定 对固定液的要求是：①能保存抗原的完整性，防止抗原的弥散；②不影响抗原–抗体反应；③保留良好的组织形态和结构；④检测不同的抗原要求不同的固定液，应根据定位的抗原分子大小，结构和性质而选择合适的固定液。

10%中性缓冲福尔马林液 40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml

影响固定的因素 固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原变性，因而要选择一合适的固定时间。

固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升高而加强，固定的温度以室温最为常用。

固定的注意事项 组织标本慎防干涸，应尽快地放入固定液固定；组织块不大于2cm2，厚0.5cm；固定液量一般不少于200毫升；固定后组织标本应彻底冲洗以去除过量的固定液。

组织的脱水、透明、浸蜡和包埋

组织切片 载玻片的处理

﹙1﹚载玻片的清洁 新载玻片常附有油质，故必须经清洁液浸泡，流水 漂洗后用蒸馏水清洗，然后浸泡于95﹪酒精内，再用绸布擦干备用。 ﹙2﹚黏附剂 为了确保染色过程不脱片，清洁后的载玻片宜涂黏附剂。涂黏附剂后玻片可置65℃恒温箱内干燥过夜后备用。

冰冻切片 石蜡切片

免疫组织化学染色 内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟

内源性碱性磷酸酶 内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内皮细胞。 阻断方法是应用1M左旋咪唑。

内源性生物素 有些脏器（如肝、胰腺及肾）的细胞含有多量的生物素或类生物素物质，它们能与卵白素反应。

非特异性背景染色 第一抗体前加与制备第一抗体相同动物的非免疫血清，封闭组织上带电荷集团而除去与第一抗体非特异性结合

增强特异性染色的方法 蛋白酶消化法 其作用是暴露抗原，增加组织和细胞的通透性，以便抗原与抗体最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。常用的有胰蛋白酶、胃蛋白酶、琏蛋白酶等

合适的抗体稀释度 抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子多过于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定是缺少抗原，而是由于抗体过量，这种现象类似于凝集反应中的前带效应（prozone effect） 抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体

抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长；③对于抗体中非特异性蛋白的，只有高稀释度时才能防止其非特异性背景染色；④稀释用缓冲液的种类，标本的固定和处理过程等也可以影响稀释度，所以合适的稀释度应根据具体情况测定。

温育时间 大部分抗体温育时间为30～60min，必要时可4℃过夜（约18h）。温育的温度常用37℃，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳

热诱导的抗原修复 抗原修复（antigen retrieval；AR）是以高温高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复处理，可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性 。现已广泛应用于免疫组织化学各领域的研究。

热诱导的抗原修复应注意的问题： 热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化时间而异，但核的破坏较轻。 如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发成改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可改尚某些抗原的修复。

呈色反应条件 底物的浓度 底物的浓度是决定酶反应速度的重要因素之一。在酶速反应之初，增加底物浓度能加快反应速度。如H2O2作为过氧化物酶形成有色终末产物的底物，若浓度较大将使显色反应极快，而致背景加深。而且过量的H2O2将产生底物抑制的酶动力现象。而抑制酶与底物形成复合物。

底物溶液的pH值 酶与底物的反应同底物的电离状况有关。底物的带电状态决定于pH值。因此pH值的调节对于底物的最适电离状况十分重要。另外，酶在其最适pH值时活性表现最大而稳定。因此应按酶和底物的最适pH值配置底物反应溶液。

最适温度 常用的温度为15～37℃。 反应时间 酶与底物的呈色反应的快慢有所不同。辣根过氧化物酶在适合的条件下为5～15分钟。一般可在显微镜下观察，当特异性染色清楚而背景清晰时可终止反应。

复 染 根据所用的底物溶液而选择复染液 DAB 有色终末产物不溶于酒精和有机溶剂，可用醇性染料复染、脱水，有机溶剂透明和封固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的底物；b、Harris苏木素复染；c、流水洗涤；d、1%盐酸酒精分化；e、流水冲洗，温水蓝化；f、梯度酒精脱水；g、二甲苯透明；h、中性树胶封固。

AEC和氯-萘酚：有色终末产物溶于酒精和有机溶剂，不能在醇性试剂中复染、脱水，并应用水溶剂封固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的底物；b、Mayers苏木素复染；c、流水冲洗，温水蓝化；d、湿润情况下水性封片剂封固。AEC易氧化引起退色，故封片时应避免气泡进入。应避免使用含有聚乙烯醇的封固剂，因为一段时间后其能溶解可溶性有色终末产物。

对 照 常用的对照方法包括：①阳性对照；②阴性对照；③阻断试验；④替代对照；⑤空白对照；⑥自身对照；⑦吸收试验。

阳性对照 用已知抗原阳性的切片做对照，与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。

阴性对照 用确认已知不含抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称为阴性对照，是阴性对照的一种。其实替代、空白、阻断、吸收试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更为重要，用以排除假阳性。

染色结果的判断 阳性细胞染色分布有三种类型：①胞浆；②细胞核；③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞胞浆，根据抗原含量染色可见于整个胞浆或部分胞浆。 阳性细胞分布可见于灶性和弥漫性。 不是所有的细胞都含有同等数量的抗原，所以染色强度不一。如果缺乏细胞间的不一致，染色常提示其反应为非特异性染色。 阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞互相交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。 切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压细胞趋不能用于判断阳性细胞，常表现为相同的染色强度。

染色失败的原因 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内，原因可能是：①染色未严格按操作步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效；③缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2量少或失效；⑤复染或脱水剂使用不当。

所有切片均为弱阳性反应：①切片在染色过程中抗体果农，或干燥了；②缓冲液配置中未加氯化钠和pH不准确，洗涤不彻底；③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长；④抗体温育时间过长；⑤H2O2浓度过高，成色速度过快；⑥粘附剂太厚。

所有切片背景过深：①为用酶消化处理切片；②切片或涂片过厚；③漂洗不够；④底物呈色反应过久；⑤蛋白质封闭不够或所用血清溶血；⑥使用全血清抗体稀释不够。

.阳性对照良好，检测性标本呈阴性反应，固定和处理不当是最常见的原因。