Dr. Sentot Santoso PhD 血小板输注讨论会 中国 ·广州 2009.4.27-4.30 同种免疫性血小板减少症诊断新方法 Dr. Sentot Santoso PhD 血小板输注讨论会 中国 ·广州 2009.4.27-4.30
同种免疫性血小板减少综合症 胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少 (FNAIT) 血小板输注无效 输注后紫癜 被动性血小板减少症 移植相关性血小板减少
FAINT的发病机制
人类血小板同种抗原
新的人类血小板同种抗原
中国人群的人类血小板同种抗原
中国人群的人类血小板同种抗原表统计
同种免疫性血小板减少症的诊断学 抗原测定 表型（PIFT, MAIPA） 基因分型（PCR-RFLP, PCR-SSP, TaqMan） 特异血清，血小板及罕见的HPA基因型 抗体测定 结合测定（PIFT, ELISA, Flowcytometry） 糖蛋白特异免疫测定法(MAIPA血小板抗原单克隆抗体固定法) 新一代血小板抗体试验？
问题 我们如何改进同种免疫性血小板减少症的诊断呢？
以稳定的细胞系为来源的DNA产品和血小板同种抗原 基因分型，来自于人类血小板同种抗原的表型的献血者的Ｂ淋巴细胞系 抗体鉴定，转染的CHO细胞稳定表达的人类血小板同种抗原
以Ｂ淋巴细胞系作为来源获得标准DNA
人类血小板同种抗原基因分型的 Ｂ淋巴细胞系 ISTH/ISBT血小板基因型鉴定实验室
特异等位片段细胞系表达人类血小板同种抗原
被转染的CHO细胞表达 ＨＰＡｓ
鉴定低频抗原HPA-8bw,-11bw,13bw引起的同种免疫反应
问题 血小板抗体测定是否可以进一步改善？
血小板抗体测定的进展
血小板抗原单克隆抗体固定法 （ＭＡＩＰＡ）
ＭＡＩＰＡ测定的步骤
抗原捕获测定的优点和缺点
新的血小板抗体测定？ （１） w/o the use of mab w/o any washing step 快速、敏感、特异、可靠 w/o the use of whole platelets w/o any washing step 快速、敏感、特异、可靠
新的血小板抗体测定？ （２） 某些血小板同种异体抗体，用现有的技术是检测不到的
漏检anti-HPA-1a 的胎儿与母亲不相容的疑似ＦＮＡＩＴ
抗体检测的影响因素 血小板抗原 三维结构 密度 表位 血小板抗体 浓度 亲和力 异质性 其他因素（比如说：配体）
血小板糖蛋白IIb/IIIa 的构象
两种类型HPA-1a 的同种异体抗体
抗原密度
异种表位：单克隆抗体
抗体表达的稳定性
新的血小板抗体测定方法 重组血小板抗原在ELISA体系中的应用
在昆虫细胞中可溶的重组人类血小板抗原产品
可溶性重组HPA-1a and -1b
用rGPIIIa抗体 检测anti-HPA-1a（ ELISA）
凝胶抗原特异测定(GASA)
血小板抗体测定： MAIPA vs. GASA
抗原-抗体的“锁与钥匙”的概念
新的血小板抗体测定方法 纯化血小板抗原或者重组血小板抗原 在SPR（表面激元共振，Surface Plasmon Resonance,SPR)中的应用
借助SPR技术的抗原-抗体相互作用的实时分析
表面等离激元（SPR） 实时蛋白质-蛋白质交互作用
在SPR中用Mabs 的HPA-1a and HPA-1b 抗原的反应
SPR技术的原则
MabSZ21: HPA-1a “Specific” 单克隆抗体SZ-21 和抗PlA1 抗体的竞争性结合及这种结合潜在的临床应用 Xi X，Zhao Y，Jiang H，Wu Q，LI P， RUAN C 中国 ·江苏血液研究所 、苏州医科大学 Nouv Rev Fr Hematol.1992;34(3):239-42
Mab SZ21 (HPA-1a类似体) 与固定的HPA-1a and HPA-1b 抗原在SPR中的反应
严重的NAIT 病例中低亲和力的HPA-1a 同种异体抗体（1）
严重的NAIT 病例中低亲和力的HPA-1a 同种异体抗体（2）
严重的NAIT 病例中低亲和力的HPA-1a 同种异体抗体（3）
人类血小板抗体的分析 动物模型？ 抗体介导的血小板清除和相关 抑制因子的测定
以NOD/SCID 鼠作为 模型进行人类血小板抗体的研究
在NOD/SCID 鼠体内循环期间人类血小板存活的动力学
FNAIT 的病理机制
Mab SZ21 抑制体内的HPA-1a 同种异体抗体介导的血小板清除？
Mab SZ21 抑制体外的HPA-1a 同种异体抗体与人类血小板的结合
Mab SZ21 抑制体内的HPA-1a 同种异体抗体介导的血小板清除
结论 基于在分子生物学基础上的HPA的第四代基因分型技术的发展，此技术可以进行快速的ＨＰＡ基因分型。参照DNA来源于永生化细胞系，可以用于基因分型的质量控制 但是，抗体的检查依然个难题。新一代的血小板抗体检测的应用（SPR技术）势在必行 对于新一代的血小板抗体检测技术，检测自然抗原，表位的复杂性，抗体的异质性等附加条件的要求是十分重要 体内试验可以研究致病的抗体和免疫介导的血小板减少症的病理机制。动物模型对于药物检测的研究必不可少
新一代血小板抗体测定？
致谢 1、 Justus Liebig University 和临床免疫输注医学研究所 （Giessen, 德国） Ines Socher ， Cornelia Andrei-Selmer ，Tamam Bakchoul，Ulrich Sachs，Hartmut Kroll 2、剑桥大学和国家健康服务血液移植（英国） PrachiStafford， Cedric Ghevaert ，Willem Ouwehand 3、血液研究所 ，（密尔沃， 基威斯康星， 美国） Peter Newman，Brian Boylan
抗HPA-1a 水平和NAIT严重程度 之间的关系